PND小鼠結(jié)腸傳輸功能、直腸敏感性和遠(yuǎn)端結(jié)腸感覺信號分子表達(dá)變化.pdf

1、盆腔神經(jīng)損傷引起的結(jié)直腸動力障礙在結(jié)直腸外科很常見，常會引起腹部脹痛、頑固性便秘、排糞不盡、直腸墜脹等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，臨床處理困難。在直腸癌手術(shù)中，有多個容易造成自主神經(jīng)損傷的危險區(qū)。有研究顯示，中低位直腸癌根治術(shù)中游離直腸造成支配直腸的盆腔自主神經(jīng)損傷引起術(shù)后排便功能障礙的發(fā)生率高達(dá)71％。臨床上觀察到，部分排便功能障礙的患者其癥狀隨時間推移呈緩慢恢復(fù)趨勢，說明機(jī)體存在適應(yīng)性恢復(fù)的機(jī)制，探討盆腔神經(jīng)損傷后的這一適應(yīng)性

2、恢復(fù)的機(jī)制對臨床防治有重要價值。
　　研究發(fā)現(xiàn)，去盆腔神經(jīng)支配(pelvic nerve denervation，PND)大鼠的結(jié)腸傳輸功能約1周可恢復(fù)。前期研究發(fā)現(xiàn)PND大鼠模型結(jié)腸黏膜瞬時受體電位通道錨蛋白亞家族成員1（transient receptor potential ankyrin1，TRPA1）蛋白水平顯著降低，但是隨著時間的推移，呈現(xiàn)恢復(fù)的趨勢，而且結(jié)腸傳輸功能的恢復(fù)與其結(jié)腸粘膜TRPA1的表達(dá)水平有相關(guān)性。提示

3、TRPA1可能參與了PND大鼠結(jié)腸動力的適應(yīng)性恢復(fù)過程。
　　TRPA1是表達(dá)于腸嗜鉻(enterochromaffin，EC)細(xì)胞的感受器分子，能夠感知腸腔內(nèi)化學(xué)與物理的刺激信號，并介導(dǎo)EC細(xì)胞釋放5-HT調(diào)控腸動力。而在眾多的5-HT受體中，5-HT3及5-HT4受體在腸粘膜感覺神經(jīng)調(diào)控中的作用最受關(guān)注。本研究擬建立PND小鼠模型，利用TRPA1基因敲除小鼠深入研究TRPA1在PND小鼠腸動力適應(yīng)性恢復(fù)過程中的作用，并觀察下游

4、的5-HT3及5-HT4受體蛋白表達(dá)水平的變化，初步了解TRPA1的作用機(jī)制。
　　目的:
　　1、建立去盆腔神經(jīng)支配(PND)小鼠模型。
　　2、了解PND小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸TRPA1蛋白的表達(dá)變化。
　　3、利用TRPA1基因敲除小鼠，探討TRPA1在PND小鼠結(jié)腸動力變化中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)對象和分組
　　1、將108只成年雄性C57小鼠隨機(jī)分為3部分:結(jié)腸傳輸試驗(yàn)36只，分

5、為PND組和假手術(shù)組，各18只。直腸敏感性試驗(yàn)36只，分為PND組和假手術(shù)組，各18只。TRPA1蛋白檢測36只，分為PND組和假手術(shù)組，各18只。
　　2、用18只野生型小鼠和18只TRPA1基因敲除小鼠建立PND模型，用于觀察遠(yuǎn)端結(jié)腸5-HT3和5-HT4受體蛋白的表達(dá)變化。
　　二、模型制備
　　1、PND模型組:小鼠開腹后分離出雙側(cè)盆腔神經(jīng)，顯微剪剪斷。
　　2、假手術(shù)組:小鼠開腹后，不剪斷盆腔神經(jīng)。

6、r>　　3、腸傳輸試驗(yàn)的小鼠，在盲腸埋入硅膠管。直腸敏感性試驗(yàn)的小鼠，在小鼠腹外斜肌處埋入鉑金電極。
　　三、檢測指標(biāo)
　　1、結(jié)腸傳輸功能檢測:術(shù)后（postoperative day，POD）第1、3、7天三個時相點(diǎn)，從預(yù)置硅膠管注射亞甲藍(lán)注射液，20分鐘后處死小鼠，通過計算各組小鼠結(jié)腸組織中亞甲藍(lán)分布占結(jié)腸組織總長度的百分比（傳輸比例）檢測結(jié)腸傳輸功能。
　　2、直腸敏感性檢測:術(shù)后第1、3、7天三個時相點(diǎn)，采用

7、結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)-內(nèi)臟運(yùn)動反射(VMR)評估各組直腸敏感性的改變。
　　3、Western Blot檢測:術(shù)后第1、3、7天三個時相點(diǎn)遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜中的TRPA1，5-HT3和5-HT4受體蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、小鼠PND模型建立情況:雙側(cè)盆腔神經(jīng)切斷后均會出現(xiàn)尿潴留，需要每日按摩膀胱協(xié)助排尿。結(jié)腸傳輸試驗(yàn)顯示:與假手術(shù)組相比，PND模型組小鼠術(shù)后第1天與第3天結(jié)腸傳輸功能顯著降低(t=10.065，2

8、.986，P＜0.001，P=0.017)，但PND模型組小鼠結(jié)腸傳輸功能隨時間推移呈顯著恢復(fù)趨勢，術(shù)后第7天時與假手術(shù)組已無差異(t=0.459，P＞0.05)。內(nèi)臟敏感性試驗(yàn)顯示PND模型組小鼠術(shù)后第1、3、7天內(nèi)臟敏感性均顯著降低(t=3.134，2.543，3.357，P=0.011，0.029，0.007)，但隨時間推移也呈恢復(fù)趨勢。
　　2、小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸TRPA1蛋白表達(dá)檢測顯示:與假手術(shù)組相比，PND模型組小鼠術(shù)后第

9、1、3天的結(jié)腸遠(yuǎn)端TRPA1蛋白表達(dá)均顯著降低（均P＜0.01），但PND模型組小鼠結(jié)腸遠(yuǎn)端TRPA1蛋白表達(dá)隨時間推移呈顯著恢復(fù)趨勢，術(shù)后第7天與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3、去盆腔神經(jīng)支配后，TRPA1敲除小鼠和野生型小鼠結(jié)腸遠(yuǎn)端5-HT3和5-HT4受體蛋白表達(dá)都呈現(xiàn)隨時間推移而恢復(fù)的趨勢。與野生型小鼠相比，TRPA1基因敲除小鼠術(shù)后第1天與第3天結(jié)腸遠(yuǎn)端5-HT3受體蛋白表達(dá)明顯降低(P=0.02，0

10、.048)，第7天無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.203)。同樣，與野生型小鼠相比，TRPA1基因敲除小鼠術(shù)后第1、3、7天結(jié)腸遠(yuǎn)端5-HT4受體蛋白表達(dá)均明顯降低(P＜0.001，P=0.036，0.011)。
　　結(jié)論:
　　1、去盆腔神經(jīng)支配后，小鼠結(jié)腸傳輸和直腸敏感性減弱，但隨時間推移可逐漸恢復(fù)。
　　2、去盆腔神經(jīng)支配后，小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸TRPA1表達(dá)顯著降低，但隨時間推移可逐漸恢復(fù)。
　　3、TRPA1基因敲除后，