富含半胱氨酸腸蛋白1(CRIP1)通過調(diào)控Fas-FasL凋亡信號通路促進結(jié)直腸癌增殖的機制研究.pdf

1、目的:
　　結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是我國前三位最常見的惡性腫瘤，同時也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因之一，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。雖然在結(jié)直腸癌發(fā)病初期，90％的病人可手術(shù)治療治愈，可是大部分病人在確診時已是癌癥晚期，預(yù)后極差。CRIP1是LIM家族成員，蛋白分子量8kDa，屬于小分子量蛋白，已經(jīng)有研究結(jié)果表明，CRIP1在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌及胰腺癌中高表達，并對疾病的預(yù)后有重要影

2、響，而在結(jié)直腸癌中的表達及功能還不甚清楚，本課題立意研究CRIP1對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響及調(diào)控機制，爭取為結(jié)直腸癌的有效治療找到新的靶點或途徑。
　　方法:
　　1.分析CRIP1在結(jié)直腸癌中的表達情況，通過實時定量PCR法檢測CRIP1在結(jié)直腸癌細胞中的mRNA水平，免疫印跡檢測其蛋白表達水平，以及免疫組化探索在結(jié)直腸癌組織及癌周組織的表達情況;
　　2.構(gòu)建CRIP1過表達載體，通過瞬時轉(zhuǎn)染后CCK8及EDU增殖

3、實驗研究過表達CRIP1后對SW620細胞增殖能力的影響，采用流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡情況，并同時采用Tunel細胞成像實驗檢測細胞的凋亡。另采用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理細胞，觀察CRIP1過表達對藥物誘導(dǎo)細胞凋亡的影響;
　　3.構(gòu)建CRIP1干擾片段，采用上述相同研究方案進行驗證;
　　4.免疫印跡探究CRIP1對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控情況，特別是對結(jié)直腸癌細胞Fas和FasL的表達調(diào)控關(guān)系，其中FasL的檢測采

4、用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定，后利用流式細胞儀及細胞成像法進行恢復(fù)試驗驗證CRIP1在Fas/FasL通路調(diào)控中的關(guān)鍵作用;
　　5.探究CRIP1對Fas的調(diào)控機制，使用熒光定量RT-PCR及免疫印跡探究CRIP1對Fas在mRNA水平及蛋白水平的影響，然后通過免疫共沉淀實驗(CO-IP)對CRIP1及Fas之間相互作用及泛素化調(diào)控機制進行探究。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析:
　　使用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行

5、分析(SPSSChicago，USA)，定量數(shù)據(jù)為3次獨立實驗結(jié)果匯總用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
　　結(jié)果:
　　1.熒光定量RT-PCR和免疫印跡檢測CRIP1在結(jié)直腸癌細胞系中mRNA水平及蛋白水平均有所表達，并且免疫組化檢測其在結(jié)直腸癌組織中高表達;
　　2.在SW620過表達CRIP1和HCT116敲低CRIP1后，CCK8及EDU增殖實驗均可證明CRIP1可促進入結(jié)直腸癌細胞增殖;流式細胞儀檢測及Tunel凋亡細胞

6、成像實驗檢測CRIP1可抑制人結(jié)直腸癌細胞的凋亡，但對細胞周期影響不明顯;
　　3.免疫印跡實驗證明CRIP1與凋亡相關(guān)蛋白呈負調(diào)控關(guān)系，尤其是與Fas，但酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)證明CRIP1對FasL的影響不明顯;流式細胞儀及細胞成像法進行恢復(fù)試驗驗證也同時證明了CRIP1對Fas的負調(diào)控從而抑制凋亡通路;
　　4.熒光定量RT-PCR實驗證明CRIP1在mRNA水平上對Fas無明顯影響，免疫共沉淀實驗(CO-IP)卻

7、證明兩者有蛋白間相互作用且CRIP1通過泛素化降解Fas。
　　結(jié)論:
　　1.CRIP1在結(jié)直腸癌細胞系中mRNA水平及蛋白水平均有所表達，且在結(jié)直腸癌組織中高表達;
　　2.CRIP1促進結(jié)直腸癌細胞增殖;
　　3.CRIP1通過抑制細胞凋亡促進結(jié)直腸癌細胞增殖;
　　4.CRIP1通過抑制Fas/FasL細胞凋亡途徑調(diào)控細胞凋亡;
　　5.CRIP1通過泛素化降解Fas抑制Fas/FasL細胞凋