LASP1候選調(diào)控蛋白S100A11多層次介導(dǎo)TGFβ-Smad信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：
　　本課題擬通過分子病理及分子生物學(xué)方法，結(jié)合體內(nèi)外研究，全方位闡明S100A11促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的作用，提供LASP1調(diào)控S100A11發(fā)揮生物學(xué)功能的直接證據(jù)，多方面實(shí)驗(yàn)論證了經(jīng)典的TGFβ/Smad信號通路通過LASP1-S100A11軸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，為確立TGFβ-LASP1-S100A11軸作為晚期結(jié)直腸癌患者臨床治療靶點(diǎn)提供充分的科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1、分析結(jié)直腸癌組織中LASP1和

2、S100A11表達(dá)的相關(guān)性，細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入外源性LASP1后檢測S100A11蛋白及mRNA的表達(dá)，激光免疫共聚焦、免疫共沉淀等方法檢測LASP1與S100A11蛋白水平的相互作用;
　　2、TGFβ處理細(xì)胞從形態(tài)學(xué)及分子表型觀察其誘導(dǎo)EMT發(fā)生，檢測下游蛋白LASP1、S100A11的表達(dá)及Smad信號通路的激活，沉默LASP1、S100A11的表達(dá)，探討其在TGFβ介導(dǎo)EMT過程中的關(guān)鍵作用;
　　3、免疫組織化學(xué)檢測臨床結(jié)

3、直腸癌組織樣本中S100A11的表達(dá)，冰凍切片免疫熒光觀察S100A11亞細(xì)胞定位，分析S100A11不同的亞細(xì)胞定位表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系;
　　4、引入核定位和核輸出信號改造S100A11重組載體，構(gòu)建不同亞細(xì)胞定位的過表達(dá)S100A11細(xì)胞系，RNA干擾技術(shù)沉默S100A11的表達(dá)，從體外水平觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討其在EMT發(fā)生過程中的作用;
　　5、構(gòu)建不同亞細(xì)胞定位的穩(wěn)定過表達(dá)S100A1

4、1細(xì)胞系，免疫印跡和免疫熒光鑒定穩(wěn)定株構(gòu)建成功，從體內(nèi)外水平觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討其在EMT發(fā)生過程中的作用;
　　6、利用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，篩選并構(gòu)建S100A11胞漿內(nèi)相互作用的信號分子及在細(xì)胞核內(nèi)相互作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，合成特異性siRNA，探討其對腫瘤生物學(xué)行為及信號通路的作用，敲除候選靶蛋白的表達(dá)分析其在TGFβ-LASP1-S100A11介導(dǎo)的生物學(xué)功能中的作用，明確S100A11胞漿和胞核水

5、平的雙重調(diào)控機(jī)制在腫瘤惡性生物學(xué)行為中的作用;
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。S100A11與臨床病理學(xué)參數(shù)之間關(guān)系用Pearson'schi-squared（x2）檢驗(yàn);Kaplan-Meier生存曲線用來統(tǒng)計(jì)S100A11單因素變量預(yù)后相關(guān)分析，多因素變量分析用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：<

6、br>　　1.LASP1在蛋白水平通過蛋白質(zhì)相互作用正向調(diào)節(jié)S100A11的表達(dá)
　　1.1 LASP1正向調(diào)節(jié)S100A11蛋白水平的表達(dá)
　　1.2分析LASP1和S100A11的相互作用
　　2.LASP1通過S100A11介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲性表型和EMT
　　2.1LASP1通過S100A11介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲性表型
　　2.2LASP1通過S100A11介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的EMT
　　

7、2.3S100A11參與TGFβ介導(dǎo)的EMT發(fā)生
　　3.胞漿胞核中S100A11在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　3.1結(jié)直腸癌組織中S100A11的表達(dá)
　　3.2結(jié)直腸癌細(xì)胞中S100A11的表達(dá)
　　3.3S100A11的表達(dá)水平與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性分析
　　Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，核、漿中S100A11過表達(dá)的結(jié)直腸癌患者總體生存率顯著低于低表達(dá)組，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P＜0

8、.05)。
　　3.4影響CRC患者預(yù)后的單因素與多因素分析
　　單因素分析提示核、漿中S100A11過表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后相關(guān)，然而，目前多因素逐步回歸分析的研究結(jié)果尚不支持將胞漿、胞核S100A11過表達(dá)作為預(yù)測患者不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)(P＞0.05)。
　　4.體外胞漿胞核中分別過表達(dá)S100A11促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲性表型并誘導(dǎo)EMT
　　4.1瞬時(shí)過表達(dá)S100A11對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖遷移和劃痕愈

9、合能力的影響
　?、賁100A11瞬時(shí)過表達(dá)效果驗(yàn)證
　?、赟100A11瞬時(shí)過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響
　?、跾100A11瞬時(shí)過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響
　　Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SW480和HCT116細(xì)胞中，瞬時(shí)過表達(dá)S100A11的細(xì)胞株與對照組(HA)相比細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯增多。
　?、躍100A11瞬時(shí)過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞劃痕愈合能力的影響
　　劃痕實(shí)

10、驗(yàn)結(jié)果顯示，瞬時(shí)過表達(dá)S100A11的細(xì)胞株與對照組(HA)相比遷移率明顯增加(P＜0.05)。
　　4.2 S100A11瞬時(shí)沉默對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲，劃痕愈合能力的影響
　?、賁100A11瞬時(shí)沉默效率驗(yàn)證
　?、赟100A11瞬時(shí)沉默對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響
　?、跾100A11瞬時(shí)沉默對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響
　?、躍100A11瞬時(shí)沉默對結(jié)直腸癌細(xì)胞劃痕愈合能力的影響
　　4.3

11、 S100A11調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　5.體內(nèi)胞漿胞核中分別過表達(dá)S100A11可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的成瘤能力和肺內(nèi)定植能力
　　5.1穩(wěn)定過表達(dá)S100A11結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480的構(gòu)建與鑒定
　　5.2 S100A11穩(wěn)定過表達(dá)體外實(shí)驗(yàn)
　　5.3 S100A11穩(wěn)定過表達(dá)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　6.S100A11調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的初步探討
　　6.1S100A11相互作用蛋白的篩選

12、>　　采用帶HA標(biāo)簽抗體的Agarose親和帶HA標(biāo)簽的S100A11融合蛋白，結(jié)合的總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離。實(shí)驗(yàn)組為SW480/HA-NES-S100A11、SW480/HA-NLS-S100A11、SW480/HA-S100A11，對照組為SW480/HA。
　　6.2Flotillin-1、Histone h1t的生物學(xué)功能
　　構(gòu)建Flotillin-1、Histone h1t過表達(dá)載體，合成特異性siRN

13、A。Transwell實(shí)驗(yàn)表明在HCT116細(xì)胞中過表達(dá)Flotillin-1、Histone h1t后，結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，且TGFβ/Smad經(jīng)典信號通路被激活;在HCT116細(xì)胞中干擾Flotillin-1、Histone h1t后，結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，且TGFβ/Smad經(jīng)典信號通路被抑制。
　　6.3Flotillin-1、Histone h1t通過TGFβ/LASP1/S100A11軸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌E

14、MT
　　為了明確S100A11胞漿中Flotillin-1、胞核中Histone h1t分別介導(dǎo)的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了如下的恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。設(shè)立Control、S100A11、S100A11+si-Histoneh1t組和Control、S100A11、S100A11+si-Flotillin-1、TGFβ+ si-Flotillin-1、 LASP1+si-Flotillin-1組，Transwell和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)

15、果均表明干擾掉Flotillin-1、Histone h1t后可中和TGFβ/LASP1/S100A11軸介導(dǎo)的遷移能力(P＜0.05)和EMT的能力。
　　結(jié)論：
　　1.結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白LASP1正向調(diào)節(jié)S100A11的蛋白表達(dá)，且LASP1和S100A11存在蛋白質(zhì)相互作用
　　2.LASP1通過S100A11介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲性表型和EMT
　　3.結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中，胞漿胞核S100A11均有

16、表達(dá)，且表達(dá)均明顯上調(diào)，與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后相關(guān);
　　4.體外實(shí)驗(yàn)表明，亞細(xì)胞定位的外源性S100A11過表達(dá)后，促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖遷移和劃痕愈合能力并誘導(dǎo)EMT;干擾S100A11后，明顯抑制結(jié)直腸癌的增殖遷移和劃痕愈合能力并抑制EMT;
　　5.體內(nèi)試驗(yàn)表明，亞細(xì)胞定位的內(nèi)源性S100A11的過表達(dá)可促進(jìn)結(jié)直腸癌的成瘤能力和肺定植能力;
　　6.S100A11下游靶蛋白胞漿中信號分子Flotllin-1、胞核中