胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Survivin、XIAP、cIAP1蛋白的表達.pdf

1、近年來，凋亡抑制因子IA P蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）因其特殊的分子結(jié)構(gòu)和抑制細胞凋亡的功能，引起許多學(xué)者們的關(guān)注。1993年Crook等在實驗中使用敲除p53基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)染宿主細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡的發(fā)生受到抑制，并且桿狀病毒的自身復(fù)制加強。研究認為，這種現(xiàn)象的發(fā)生是由于桿狀病毒中存在一種與p53基因作用途徑不同的基因序列，由于它抑制了細胞凋亡的發(fā)生，所以將其命名為細胞凋亡

2、抑制基因，其所編碼的蛋白被稱為細胞凋亡抑制蛋白。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，IAP蛋白在原核細胞生物和真核細胞生物中都有表達，并根據(jù)其同源性克隆出了多種IAP蛋白，稱為IAP蛋白家族。人類目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9個成員，分別是：XIAP、cIAP1、cIAP2、NAIP、ML-IAP、Survivin、apollon、Livin、BRUCE。 IAP蛋白家族主要的結(jié)構(gòu)特征是含有桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)（baculoviral IAP repeat，B

3、IR）、環(huán)指結(jié)構(gòu)域（Ring-finger domain）和凋亡蛋白酶聯(lián)合募集結(jié)構(gòu)域（Caspase-associated recruitment domains，CARDs）。IAP蛋白家族成員共同結(jié)構(gòu)特點是氮端含有一個或多個由80個氨基酸組成的BIR結(jié)構(gòu)域，而大部分C末端含有一個鋅指結(jié)構(gòu)。其中，BIR（baculoviral IAP repeat，桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)）結(jié)構(gòu)域位于IAP氨基端，是IAP家族成員共同的分子特征，為抑制

4、細胞凋亡的功能區(qū)域。IAP蛋白家族中所有成員都能不同程度上抑制細胞凋亡，主要是通過內(nèi)源性途徑直接抑制凋亡的核心物質(zhì)Caspase（Cytosolic aspartate-specific proteases，胱天蛋白酶）蛋白酶的活性來有效抑制細胞凋亡的調(diào)節(jié)因子。Survivin是耶魯大學(xué)Altieri等在人類基因組庫的雜交篩選中分離出的凋亡抑制蛋白。Survivin可以直接作用于Caspase-3和Caspase-7，阻斷細胞的凋亡過

5、程。XIAP是Peter等于1996年在人的胚胎腦組織細胞中克隆出的IAP蛋白家族中作用最強的一員，其基因定位于X染色體的Xq2 4-2 5， 編碼區(qū)由7個外顯子組成，cDNA由2540bp堿基組成；編碼含497個氨基酸，分子質(zhì)量為54 kD。XIAP可直接抑制凋亡起始因子caspase-9以及效應(yīng)分子caspase-3與caspase-7的活性，抑制細胞對外源性凋亡誘導(dǎo)信號誘導(dǎo)的細胞凋亡，參與腫瘤細胞的異常增殖。cIAP1定位于染色體

6、11q222 q23，cIAP1可以直接結(jié)合并抑制caspase-3和caspase-7，從而直接阻斷凋亡。 近年來，研究發(fā)現(xiàn)凋亡抑制蛋白與胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生和發(fā)展有著較大的關(guān)系。胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生是一個多步驟、多因素進行性發(fā)展的過程，它的發(fā)生、發(fā)展與某些的癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)。在胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中，通過合成、釋放或引起宿主相應(yīng)的反應(yīng)而產(chǎn)生各種可檢測到的分子生物學(xué)指標是當(dāng)前學(xué)者們關(guān)注的重點。IAP

7、蛋白家族在正常細胞幾乎不表達，而在癌細胞表達顯著升高，有類似于癌基因的特點。因此，研究凋亡抑制因子——IAP蛋白家族中Survivin、XIAP、cIAP1在胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的表達情況，將有助于進一步探討胃癌的發(fā)病機理，從而對胃癌的預(yù)防、治療和預(yù)后評估提供理論依據(jù)。目前，國內(nèi)外對IAP蛋白家族中Survivin蛋白在胃癌及癌前病變中的表達情況報道較多，關(guān)于XIAP、cIAP1的報道較少。本研究希望通過檢測胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中

8、的慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌組織中Survivin. XIAP及cIAP1蛋白表達的差異，從一個側(cè)面探討胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生、發(fā)展機制，為進一步臨床診治及預(yù)后判斷提供實驗依據(jù)。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染導(dǎo)致的胃粘膜慢性炎癥可刺激胃粘膜上皮細胞的過度增殖，可直接或間接增加胃上皮細胞增生率，持續(xù)感染可逐步引起胃上皮細胞的變性、壞死及萎縮，繼之出現(xiàn)腸上皮化生甚至致胃癌的形成。Hp感染與胃癌的

9、發(fā)生關(guān)系密切已達成共識，Hp感染致胃癌的機制仍未明了。一般認為Hp感染是胃癌發(fā)生、發(fā)展進程中的首要推動因子。Hp感染是否能促進胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Survivin、XIAP及cIAP1蛋白的表達增高尚不清楚。 研究目的: 本文通過檢測胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌組織中Survivin、XIAP及cIAP1蛋白表達的差異以及其與Hp感染的關(guān)系，探討IAP家族蛋白對胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的

10、影響，從一個側(cè)面研究胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生、發(fā)展機制，為進一步臨床診治及預(yù)后判斷提供實驗依據(jù)。 材料與方法: 1、Survivin、XIAP、cIAP1蛋白表達檢測：選取慢性淺表性胃炎25例、萎縮性胃炎伴腸化30例、胃癌32例，通過免疫組化二步法.即用型二步法檢測Survivin、XIAP、cIAP1蛋白的表達。 2、體內(nèi)實驗通過對所有病例進行尿素酶試驗檢測Hp感染情況，分析Hp感染與Survivin、XIAP、

11、cIAP1蛋白的關(guān)系；體外實驗通過將Hp裂解液與胃癌細胞AGS共同孵育，24h后提取細胞總蛋白通過Western Blot檢測Survivin、XIAP、cIAP1蛋白水平的變化。 3、數(shù)據(jù)統(tǒng)計：免疫組織化學(xué)蛋白細胞核和胞漿表達差異采用多組等級資料的秩和檢驗（Kruskal-Wallis H），對各組間進行Mann-Whitney Test檢測每兩組病種三個蛋白表達的差異，以P<0.0167則認為有顯著性差異。Survivin、

12、XIAP、cIAP1蛋白三者在慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌中的表達與Hp的關(guān)系采用X2檢驗。Western Blot檢驗結(jié)果采用三次灰度值x±SD表示，使用兩樣本t檢驗分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，以雙側(cè)α=0.05作為檢驗水準。以P<0.05則認為有顯著性差異。 結(jié)果: 1、在慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌中患者性別各組間無顯著性差異（X2=0.571，P=0.752）；

13、慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌中患者平均年齡具有顯著性差異（P=0.000）。 2、Survivin蛋白陽性表達定位于細胞核，少部分定位于胞漿。Survivin蛋白表達從慢性淺表性胃炎到萎縮性胃炎伴腸化到胃癌呈逐漸上升趨勢，經(jīng)多組等級資料的秩和檢驗方法（Kruskal-Wallis H），差異有顯著性意義（X2=24.722，P=0.000）。各組間進行Mann-Whitney Test檢測每兩組病種Survivin蛋白

14、表達的差異，結(jié)果顯示慢性淺表性胃炎與萎縮性胃炎伴腸化兩組間（Z=-3.813，P=0.000）、慢性淺表性胃炎與胃癌兩組間表達有顯著性差異（Z=-4.675，P=0.000），萎縮性胃炎伴腸化與胃癌兩組間表達無顯著性差異（Z=-1.664，P=0.096）。 3、XIAP蛋白陽性表達定位于定位于胞漿。XIAP蛋白表達從慢性淺表性胃炎到萎縮性胃炎伴腸化到胃癌呈逐漸上升趨勢，差異有顯著性意義（X2=33.583，P=0.000）。檢

15、測每兩組病種XIAP蛋白表達的差異，結(jié)果顯示慢性淺表性胃炎與萎縮性胃炎伴腸化兩組間（Z=-5.176，P=0.000）、慢性淺表性胃炎與胃癌兩組間表達有顯著性差異（Z=-5.132，P=0.000），萎縮性胃炎伴腸化與胃癌兩組間表達無顯著性差異（Z=-0.921，P=0.362）。 4、cIAP1蛋白陽性表達定位于細胞核。cIAP1蛋白表達從慢性淺表性胃炎到萎縮性胃炎伴腸化到胃癌呈逐漸上升趨勢，差異有顯著性意義（X2=38.72

16、4，P=0.000）。檢測每兩組病種cIAP1表達的差異，結(jié)果顯示慢性淺表性胃炎與萎縮性胃炎伴腸化兩組間（Z=-4.462，P=0.000）、慢性淺表性胃炎與胃癌兩組間（Z=-5.534，P=0.000）、萎縮性胃炎伴腸化與胃癌兩組間表達均有顯著性差異（Z=-3.007，P=0.003）。 5、Hp感染在胃上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中與Survivin、XIAP和cIAP1蛋白表達量的關(guān)系分析。將免疫組化結(jié)果與尿素酶實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)

17、分析發(fā)現(xiàn)，Hp感染伴胃上皮細胞Survivin、XIAP和cIAP1蛋白的表達升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P均> 0.05）。體外實驗結(jié)果顯示，加入Hp共同孵育的實驗組Survivin和XIAP蛋白表達量明顯較陰性對照組高（兩樣本t檢驗，t=-12.624和-14.974， P=0.000和0.000），cIAP1蛋白表達量較陰性對照組高，但統(tǒng)計學(xué)無差異（t=-2.461，P=0.070）。 結(jié)論: 1、胃上皮細胞在惡性轉(zhuǎn)化過