胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Survivin、XIAP、cIAP1蛋白的表達(dá).pdf

1、近年來，凋亡抑制因子IA P蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）因其特殊的分子結(jié)構(gòu)和抑制細(xì)胞凋亡的功能，引起許多學(xué)者們的關(guān)注。1993年Crook等在實(shí)驗(yàn)中使用敲除p53基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的發(fā)生受到抑制，并且桿狀病毒的自身復(fù)制加強(qiáng)。研究認(rèn)為，這種現(xiàn)象的發(fā)生是由于桿狀病毒中存在一種與p53基因作用途徑不同的基因序列，由于它抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，所以將其命名為細(xì)胞凋亡

2、抑制基因，其所編碼的蛋白被稱為細(xì)胞凋亡抑制蛋白。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，IAP蛋白在原核細(xì)胞生物和真核細(xì)胞生物中都有表達(dá)，并根據(jù)其同源性克隆出了多種IAP蛋白，稱為IAP蛋白家族。人類目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9個(gè)成員，分別是：XIAP、cIAP1、cIAP2、NAIP、ML-IAP、Survivin、apollon、Livin、BRUCE。 IAP蛋白家族主要的結(jié)構(gòu)特征是含有桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)（baculoviral IAP repeat，B

3、IR）、環(huán)指結(jié)構(gòu)域（Ring-finger domain）和凋亡蛋白酶聯(lián)合募集結(jié)構(gòu)域（Caspase-associated recruitment domains，CARDs）。IAP蛋白家族成員共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是氮端含有一個(gè)或多個(gè)由80個(gè)氨基酸組成的BIR結(jié)構(gòu)域，而大部分C末端含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。其中，BIR（baculoviral IAP repeat，桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)）結(jié)構(gòu)域位于IAP氨基端，是IAP家族成員共同的分子特征，為抑制

4、細(xì)胞凋亡的功能區(qū)域。IAP蛋白家族中所有成員都能不同程度上抑制細(xì)胞凋亡，主要是通過內(nèi)源性途徑直接抑制凋亡的核心物質(zhì)Caspase（Cytosolic aspartate-specific proteases，胱天蛋白酶）蛋白酶的活性來有效抑制細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子。Survivin是耶魯大學(xué)Altieri等在人類基因組庫的雜交篩選中分離出的凋亡抑制蛋白。Survivin可以直接作用于Caspase-3和Caspase-7，阻斷細(xì)胞的凋亡過

5、程。XIAP是Peter等于1996年在人的胚胎腦組織細(xì)胞中克隆出的IAP蛋白家族中作用最強(qiáng)的一員，其基因定位于X染色體的Xq2 4-2 5， 編碼區(qū)由7個(gè)外顯子組成，cDNA由2540bp堿基組成；編碼含497個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為54 kD。XIAP可直接抑制凋亡起始因子caspase-9以及效應(yīng)分子caspase-3與caspase-7的活性，抑制細(xì)胞對外源性凋亡誘導(dǎo)信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，參與腫瘤細(xì)胞的異常增殖。cIAP1定位于染色體

6、11q222 q23，cIAP1可以直接結(jié)合并抑制caspase-3和caspase-7，從而直接阻斷凋亡。 近年來，研究發(fā)現(xiàn)凋亡抑制蛋白與胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生和發(fā)展有著較大的關(guān)系。胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素進(jìn)行性發(fā)展的過程，它的發(fā)生、發(fā)展與某些的癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)。在胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中，通過合成、釋放或引起宿主相應(yīng)的反應(yīng)而產(chǎn)生各種可檢測到的分子生物學(xué)指標(biāo)是當(dāng)前學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)。IAP

7、蛋白家族在正常細(xì)胞幾乎不表達(dá)，而在癌細(xì)胞表達(dá)顯著升高，有類似于癌基因的特點(diǎn)。因此，研究凋亡抑制因子——IAP蛋白家族中Survivin、XIAP、cIAP1在胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的表達(dá)情況，將有助于進(jìn)一步探討胃癌的發(fā)病機(jī)理，從而對胃癌的預(yù)防、治療和預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。目前，國內(nèi)外對IAP蛋白家族中Survivin蛋白在胃癌及癌前病變中的表達(dá)情況報(bào)道較多，關(guān)于XIAP、cIAP1的報(bào)道較少。本研究希望通過檢測胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中

8、的慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌組織中Survivin. XIAP及cIAP1蛋白表達(dá)的差異，從一個(gè)側(cè)面探討胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為進(jìn)一步臨床診治及預(yù)后判斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染導(dǎo)致的胃粘膜慢性炎癥可刺激胃粘膜上皮細(xì)胞的過度增殖，可直接或間接增加胃上皮細(xì)胞增生率，持續(xù)感染可逐步引起胃上皮細(xì)胞的變性、壞死及萎縮，繼之出現(xiàn)腸上皮化生甚至致胃癌的形成。Hp感染與胃癌的

9、發(fā)生關(guān)系密切已達(dá)成共識(shí)，Hp感染致胃癌的機(jī)制仍未明了。一般認(rèn)為Hp感染是胃癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的首要推動(dòng)因子。Hp感染是否能促進(jìn)胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Survivin、XIAP及cIAP1蛋白的表達(dá)增高尚不清楚。 研究目的: 本文通過檢測胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌組織中Survivin、XIAP及cIAP1蛋白表達(dá)的差異以及其與Hp感染的關(guān)系，探討IAP家族蛋白對胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的

10、影響，從一個(gè)側(cè)面研究胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為進(jìn)一步臨床診治及預(yù)后判斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法: 1、Survivin、XIAP、cIAP1蛋白表達(dá)檢測：選取慢性淺表性胃炎25例、萎縮性胃炎伴腸化30例、胃癌32例，通過免疫組化二步法.即用型二步法檢測Survivin、XIAP、cIAP1蛋白的表達(dá)。 2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過對所有病例進(jìn)行尿素酶試驗(yàn)檢測Hp感染情況，分析Hp感染與Survivin、XIAP、

11、cIAP1蛋白的關(guān)系；體外實(shí)驗(yàn)通過將Hp裂解液與胃癌細(xì)胞AGS共同孵育，24h后提取細(xì)胞總蛋白通過Western Blot檢測Survivin、XIAP、cIAP1蛋白水平的變化。 3、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：免疫組織化學(xué)蛋白細(xì)胞核和胞漿表達(dá)差異采用多組等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis H），對各組間進(jìn)行Mann-Whitney Test檢測每兩組病種三個(gè)蛋白表達(dá)的差異，以P<0.0167則認(rèn)為有顯著性差異。Survivin、

12、XIAP、cIAP1蛋白三者在慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌中的表達(dá)與Hp的關(guān)系采用X2檢驗(yàn)。Western Blot檢驗(yàn)結(jié)果采用三次灰度值x±SD表示，使用兩樣本t檢驗(yàn)分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以雙側(cè)α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。以P<0.05則認(rèn)為有顯著性差異。 結(jié)果: 1、在慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌中患者性別各組間無顯著性差異（X2=0.571，P=0.752）；

13、慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、胃癌中患者平均年齡具有顯著性差異（P=0.000）。 2、Survivin蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，少部分定位于胞漿。Survivin蛋白表達(dá)從慢性淺表性胃炎到萎縮性胃炎伴腸化到胃癌呈逐漸上升趨勢，經(jīng)多組等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)方法（Kruskal-Wallis H），差異有顯著性意義（X2=24.722，P=0.000）。各組間進(jìn)行Mann-Whitney Test檢測每兩組病種Survivin蛋白

14、表達(dá)的差異，結(jié)果顯示慢性淺表性胃炎與萎縮性胃炎伴腸化兩組間（Z=-3.813，P=0.000）、慢性淺表性胃炎與胃癌兩組間表達(dá)有顯著性差異（Z=-4.675，P=0.000），萎縮性胃炎伴腸化與胃癌兩組間表達(dá)無顯著性差異（Z=-1.664，P=0.096）。 3、XIAP蛋白陽性表達(dá)定位于定位于胞漿。XIAP蛋白表達(dá)從慢性淺表性胃炎到萎縮性胃炎伴腸化到胃癌呈逐漸上升趨勢，差異有顯著性意義（X2=33.583，P=0.000）。檢

15、測每兩組病種XIAP蛋白表達(dá)的差異，結(jié)果顯示慢性淺表性胃炎與萎縮性胃炎伴腸化兩組間（Z=-5.176，P=0.000）、慢性淺表性胃炎與胃癌兩組間表達(dá)有顯著性差異（Z=-5.132，P=0.000），萎縮性胃炎伴腸化與胃癌兩組間表達(dá)無顯著性差異（Z=-0.921，P=0.362）。 4、cIAP1蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核。cIAP1蛋白表達(dá)從慢性淺表性胃炎到萎縮性胃炎伴腸化到胃癌呈逐漸上升趨勢，差異有顯著性意義（X2=38.72

16、4，P=0.000）。檢測每兩組病種cIAP1表達(dá)的差異，結(jié)果顯示慢性淺表性胃炎與萎縮性胃炎伴腸化兩組間（Z=-4.462，P=0.000）、慢性淺表性胃炎與胃癌兩組間（Z=-5.534，P=0.000）、萎縮性胃炎伴腸化與胃癌兩組間表達(dá)均有顯著性差異（Z=-3.007，P=0.003）。 5、Hp感染在胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中與Survivin、XIAP和cIAP1蛋白表達(dá)量的關(guān)系分析。將免疫組化結(jié)果與尿素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

17、分析發(fā)現(xiàn)，Hp感染伴胃上皮細(xì)胞Survivin、XIAP和cIAP1蛋白的表達(dá)升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均> 0.05）。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入Hp共同孵育的實(shí)驗(yàn)組Survivin和XIAP蛋白表達(dá)量明顯較陰性對照組高（兩樣本t檢驗(yàn)，t=-12.624和-14.974， P=0.000和0.000），cIAP1蛋白表達(dá)量較陰性對照組高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異（t=-2.461，P=0.070）。 結(jié)論: 1、胃上皮細(xì)胞在惡性轉(zhuǎn)化過