登革病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法建立及2006年陽(yáng)江地區(qū)登革熱流行狀況調(diào)查.pdf

1、一、研究背景和目的: 登革病毒（Dengue virus，DV）為黃病毒屬成員，是引起登革熱（Dengue fever，DF）和登革出血熱（Dengue haemorrhagic fever，DHF）/登革休克綜合征（Dengue shock syndrome，DSS）的病原體，有4種不同的血清型（1-4型），主要傳播媒介是埃及伊蚊和白蚊伊蚊。目前登革病毒感染引起的疾病主要流行于亞洲、非洲、美洲和太平洋島嶼的熱帶和亞熱帶地區(qū)。我

2、國(guó)自1978年以來(lái)主要在海南、廣東、廣西、臺(tái)灣和福建等東南沿海地區(qū)發(fā)生。世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球每年登革熱發(fā)病人數(shù)約5千萬(wàn)到1億，并導(dǎo)致25至50萬(wàn)登革出血熱病例和2．4萬(wàn)人死亡。登革熱已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，建立快速、簡(jiǎn)便、高效、廉價(jià)的登革病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法是及時(shí)開(kāi)展臨床救治和流行病學(xué)調(diào)查，并最終控制其傳播流行的可靠途徑。 對(duì)登革熱典型病例的臨床診斷并不難，根據(jù)其臨床癥狀及流行情況即可診斷。但對(duì)非典型病例或疑似病例必須

3、進(jìn)一步作實(shí)驗(yàn)室診斷才能確診，早期快速的診斷也可大大減少DF的發(fā)病率和病死率，因此準(zhǔn)確快速實(shí)驗(yàn)室診斷方法的建立對(duì)DF和DHF的確診至關(guān)重要。多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）是檢測(cè)病原的一種簡(jiǎn)便、敏感、特異的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，但是由于PCR方法高度敏感，如檢測(cè)樣本或試劑受到微量的目的DNA片段污染后很容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，影響其檢測(cè)結(jié)果的可靠性。熒光定量PCR檢測(cè)方法是將PCR與液相探針雜交相結(jié)合一種檢測(cè)方法，與常規(guī)PCR方法相比，它具有特異性更強(qiáng)、

4、敏感性更高、檢測(cè)速度更快，并能有效地解決PCR污染問(wèn)題的特點(diǎn)。目前國(guó)際公認(rèn)熒光定量PCR方法是最準(zhǔn)確、重復(fù)性最好的核酸定量檢測(cè)方法，已開(kāi)始用于多種病毒、細(xì)菌感染標(biāo)本的檢測(cè)，本研究將探討該檢測(cè)方法應(yīng)用于登革病毒感染的早期診斷的可行性。 二、研究方法: 1、用C6/36細(xì)胞和乳鼠培養(yǎng)登革病毒，并用于病毒的保種。 2、利用生物信息學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)比較登革病毒基因組和各主要功能基因核苷酸序列同源性，確定不同血清型登革病毒基因

5、組特征。 3、熒光定量PCR方法的初步建立：收集DV1～4型標(biāo)準(zhǔn)株（DV1夏威夷株、DV2NGC株、DV3 H87株、DV4 H241株），提取四個(gè)血清型登革病毒的RNA，以之為模板，在現(xiàn)有的熒光PCR檢測(cè)儀上建立熒光定量PCR方法。 4、敏感性初步評(píng)價(jià)：將新建立的方法與本實(shí)驗(yàn)室已建立常規(guī)PCR方法進(jìn)行敏感性實(shí)驗(yàn)比較。利用核酸分析儀檢測(cè)模板核酸的濃度，進(jìn)行梯度稀釋，以不同稀釋度的核酸材料為模板，確定可分別檢測(cè)到的病毒滴度

6、。 5、特異性初步評(píng)價(jià)：提取其他黃病毒科成員如西尼羅病毒的核酸，以之為模板，采用新建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，以確定所建立方法的特異性。 6、臨床標(biāo)本的初步檢測(cè)實(shí)驗(yàn)：利用本實(shí)驗(yàn)室已收集的登革熱病人急性期血清樣本，進(jìn)行臨床標(biāo)本檢測(cè)的初步研究，確定本方法在臨床應(yīng)用的可行性。 7、調(diào)查陽(yáng)江市2006年登革病毒的流行情況，根據(jù)發(fā)病者的年齡、職業(yè)分布情況、發(fā)病時(shí)間等分析其流行及發(fā)展趨勢(shì)，尋找預(yù)防控制措施。 三、研究結(jié)果:

7、 1、通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物培養(yǎng)，收獲了四種DV標(biāo)準(zhǔn)株的培養(yǎng)物。 2、DV 3'端非編碼區(qū)的一段序列高度保守，所采用針對(duì)該區(qū)片段的適用于DV1～4型檢測(cè)用的通用引物和探針具有可靠性。 3、建立DV熒光定量PCR檢測(cè)方法，以DV1～4型標(biāo)準(zhǔn)株的RNA為模板，不同型別的DV均可見(jiàn)到陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，表明所采用的引物和探針及反應(yīng)體系是合適的。 4、靈敏度的檢測(cè)。以不同稀釋度的核酸材料為模板，檢測(cè)的靈敏度均達(dá)105拷貝/ml。

8、 5、對(duì)其他黃病毒科成員如西尼羅病毒的核酸，以之為模板，采用新建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增。 6、在所取的10份血清樣本中，有6例出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，軟件自動(dòng)分析顯示，病毒含量在103～107拷貝/ml。 四、結(jié)論: 1、本研究所建立的熒光定量PCR方法可用于登革病毒感染急性期患者血清標(biāo)本快速診斷。實(shí)驗(yàn)中所采用的DV通用探針和引物位于DV全基因組中相對(duì)保守的3’ NC端，在理論上可用于登革病毒所有4個(gè)血清

9、型的基因檢測(cè)。以登革病毒4個(gè)血清型的標(biāo)準(zhǔn)株提取核酸作為模板，可得到陽(yáng)性結(jié)果，證明所設(shè)計(jì)引物和探針的有效性。 2、兩步法進(jìn)行RT-PCR，整個(gè)過(guò)程約需3～4h。采用該方法對(duì)10份發(fā)熱1～2d患者血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，有6份呈陽(yáng)性反應(yīng)，初步證明本方法在臨床上的有效性，表明該方法可能適合于登革熱病人早期診斷。在本研究中，將陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品與樣本進(jìn)行同條件的FQ RT-PCR，在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上，通過(guò)軟件自動(dòng)分析得出陽(yáng)性標(biāo)本中病毒含量在1