α-干擾素抗小鼠肝纖維化相關(guān)免疫機(jī)制研究.pdf

1、前言
　　 肝纖維化是繼發(fā)于肝臟炎癥或損傷后組織修復(fù)過(guò)程中的代償性反應(yīng),也是向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié),肝纖維化最終可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。肝纖維化有逆轉(zhuǎn)的可能性,因此,在此階段的有效治療無(wú)疑是肝硬化甚至肝癌防治工作的重中之重。
　　 α-干擾素(Interferon-alpha,IFN-α)是由白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和病毒感染的組織細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的一類(lèi)具有多種生物活性的糖蛋白,具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。目前,臨床上

2、已用于治療肝纖維化,但具體抗纖維化機(jī)制尚不明確。
　　 四氯化碳(CCl4)致使小鼠肝纖維化為探討IFN-α抗小鼠肝纖維化免疫應(yīng)答機(jī)制提供了一個(gè)寶貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,多種免疫細(xì)胞通過(guò)合成分泌不同的細(xì)胞因子、趨化因子等化學(xué)介質(zhì)介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)。在各種因素導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)急性階段,受損肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及被激活的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)可分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子,趨化

3、肝組織及血循環(huán)中的天然免疫細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞)及獲得性免疫細(xì)胞(T細(xì)胞和B細(xì)胞)浸潤(rùn)損傷部位,介導(dǎo)急性期的免疫炎癥反應(yīng)及損傷組織的修復(fù)反應(yīng);在慢性炎癥階段,炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)循環(huán)交替、HSC持續(xù)激活、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成與分解代謝失衡,過(guò)度沉積于肝臟,導(dǎo)致肝纖維化。細(xì)胞因子、趨化因子與免疫細(xì)胞共同構(gòu)成影響肝星狀細(xì)胞的免疫微環(huán)境。用藥物總體調(diào)節(jié)肝臟的免疫微環(huán)境,誘導(dǎo)免疫細(xì)

4、胞向逆轉(zhuǎn)肝纖維化的功能方向發(fā)展,可能成為治療肝纖維化的一種新思路,對(duì)闡明肝纖維化發(fā)病機(jī)制及探索肝纖維化治療靶點(diǎn)具有重要意義。
　　 我們利用成功建立的小鼠肝纖維化模型,分析了參與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展及結(jié)局的免疫應(yīng)答調(diào)控的相關(guān)因素,動(dòng)態(tài)觀(guān)察IFN-α不同劑量組在不同治療周期對(duì)小鼠肝纖維化結(jié)局的影響、肝(局部)脾(全身)免疫效應(yīng)細(xì)胞及產(chǎn)生細(xì)胞因子的變化,以期為肝纖維化的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、實(shí)驗(yàn)

5、動(dòng)物及主要試劑
　　 6～8周齡、雌性BALB/c小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(許可證編號(hào):SCXK京200420001);四氯化碳(CCl4):分析純,上海長(zhǎng)江化工廠(chǎng);橄欖油:山東魯花集團(tuán)產(chǎn)品;注射用重組人IFN-α2b:購(gòu)自美國(guó)先靈葆雅,批號(hào):010L30201;蘇木素、伊紅購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Masson三色膠原試劑盒及即用型SP超敏試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;流式單克隆抗體:購(gòu)自美國(guó)BD公司及

6、eBioscience公司。
　　 2、動(dòng)物模型制作、分組及相應(yīng)處理
　　 (1)制作肝纖維化小鼠模型:腹腔注射10%CCl4(橄欖油稀釋)5μl/g,2次/周,共8周(前兩次劑量減半)。
　　 (2)分組及治療:將肝纖維化小鼠分為A組(生理鹽水組)、B組(IFN-α低劑量組)、C組(IFN-α中劑量組)、D組(IFN-α高劑量組),分別給予治療。另設(shè)正常對(duì)照組E組。注:A組:0.9%注射用水;B組:IFN-α4

7、00U/只,100μl;C組:IFN-α800U/只,100μl;D組:IFN-α1200U/只,100μl。隔日皮下注射,現(xiàn)用現(xiàn)配(前三次劑量減半)。
　　 3、病理切片制作
　　 殺鼠取其肝臟,在肝左葉組織同部位取2塊,每塊組織約1cm×1cm×0.5cm大小,立即放入10%甲醛溶液中固定保存,備檢。切片做病理HE染色和MASSON染色。
　　 4、脾細(xì)胞培養(yǎng)
　　 α-干擾素治療小鼠三周、六周和八周

8、常規(guī)無(wú)菌取出脾臟,用10ml含5%熱滅活FCS的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,350×g,室溫離心10分鐘。經(jīng)0.17MNH4Cl裂解紅細(xì)胞、RPMI1640洗滌2次,以臺(tái)盼藍(lán)檢查脾細(xì)胞活性,確定活細(xì)胞超過(guò)90%。用含10%熱滅活FCS的RPMI1640將脾細(xì)胞終濃度調(diào)至1×107個(gè)/ml,24孔培養(yǎng)板(FALCON),每孔加入500μl細(xì)胞懸液,一式3孔,培養(yǎng)48h。350×g室溫離心10min,收集上清,-80℃保存,待細(xì)胞因

9、子測(cè)定。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠肝臟及脾臟細(xì)胞
　　 FACS檢測(cè)CD11c+CD11b+DCs(mDCs)、CD11c+B220+DCs(pDCs)、CD4+CD69+T細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞(Tregs)、F4/80巨噬細(xì)胞。
　　 6、細(xì)胞因子檢測(cè)
　　 雙抗體夾心ELISA法對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-10及TGF-β的含量分別進(jìn)行檢測(cè),酶標(biāo)儀(InterMed

10、NJ-2100)測(cè)定450nm處OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA分析)及多重比較(Dunnett-t檢驗(yàn)),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、IFN-α對(duì)肝纖維化小鼠肝組織病理的影響
　　 造模成功與否判斷:造模6周及8周后分

11、別取2只鼠,取肝臟做病理HE染色驗(yàn)證其肝纖維化模型是否成功。匯管區(qū)周?chē)w維化明顯,有芒狀纖維和纖維間隔形成。中度肝纖維化形成即可。(纖維隔形成并互相連接深入小葉內(nèi),小葉結(jié)構(gòu)保留或紊亂,但無(wú)肝硬化。)
　　 與生理鹽水組相比,IFN-α高、中及低劑量治療組肝組織纖維化程度明顯好轉(zhuǎn),尤其是中劑量治療組療效在治療六周時(shí)更加顯著。
　　 2、IFN-α對(duì)肝纖維化小鼠治療過(guò)程中相關(guān)免疫細(xì)胞的影響
　　 治療三周,生理鹽水組

12、小鼠肝臟mDC百分比顯著高于正常組、IFN-α中劑量組(P＜0.05)。整個(gè)治療周期,各組問(wèn)小鼠脾臟mDC、脾臟及肝臟pDC未見(jiàn)有意義的差別。組間小鼠脾臟活化T細(xì)胞未見(jiàn)有意義的差別。治療八周后,生理鹽水組小鼠肝臟活化T細(xì)胞百分比顯著高于IFN-α低、中及高劑量組(P＜0.05)。組間小鼠肝臟巨噬細(xì)胞未見(jiàn)顯著差別,但可見(jiàn)各治療組肝臟巨噬細(xì)胞有下降的趨勢(shì)。治療三周后,生理鹽水組小鼠脾臟巨噬細(xì)胞百分比顯著高于IFN-α低、中和高劑量組(P＜0

13、.05)。整個(gè)治療周期,IFN-α三個(gè)劑量組小鼠肝臟Treg高于正常組和生理鹽水組,相反,治療八周后,生理鹽水組小鼠脾臟Treg顯著高于IFN-α中、高劑量組(P＜0.05)。
　　 3、IFN-α對(duì)肝纖維化小鼠治療過(guò)程中相關(guān)免疫分子的影響
　　 在治療初期,生理鹽水組IL-10濃度顯著高于IFN-α中、高劑量組(P＜0.05)。治療六周時(shí),IFN-α中、高劑量組IL-10濃度顯著增高。治療初期,肝纖維化小鼠脾上清TGF

14、-β濃度均高于正常組,治療六周后,IFN-α中、高劑量組TGF-β濃度顯著下降(P＜0.05),近于正常。IFN-α治療組小鼠脾上清IFN-γ濃度均高于生理鹽水組,治療六周后,IFN-α中劑量組小鼠脾上清IFN-γ濃度顯著高于生理鹽水組(P＜0.05)。提示IL-10、IFN-γ均有抗肝纖維化作用,而TGF-β存在促肝纖維化作用。
　　 結(jié)論
　　 1、IFN-α存在直接抗肝纖維化作用,尤其是中劑量組在治療六周效果更為顯