非諾貝特和替米沙坦對大鼠胰島素抵抗的影響及其作用機制的探討.pdf

1、隨著人們生活質(zhì)量的提高和生活方式的改變，肥胖已成為一種新的流行性疾病，并常與其他疾病如高血壓、脂質(zhì)代謝障礙、高胰島素血癥、葡萄糖耐量減低和2型糖尿病并存。這種多種心血管危險因素的同時存在，被稱為代謝綜合征。肥胖特別是腹部肥胖是胰島素抵抗和代謝綜合征的主要發(fā)病因素。減輕體重、改善胰島素抵抗已成為臨床治療代謝綜合征的重要目標。大量臨床試驗已經(jīng)證實一些血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARBs)亞型用于高血壓治療時能減少新發(fā)2型糖尿病的出現(xiàn)，減少心血管

2、疾病發(fā)生的危險。微?；侵Z貝特用于治療高甘油三酯血癥和低高密脂蛋白血癥等脂質(zhì)異常時也能預(yù)防和延緩冠心病的發(fā)展、改善臨床預(yù)后。但關(guān)于這兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用能否產(chǎn)生更大的臨床益處或出現(xiàn)其它的副作用，目前并不十分清楚。因此，本文的研究目的是探討非諾貝特和替米莎坦對胰島素抵抗大鼠的胰島功能和糖脂代謝的影響及其可能作用的機制，為代謝綜合征臨床治療對策的選擇提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1、材料
　　 健康雄性Wi

3、star大鼠60只（體重140～200g，購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心）;微電腦數(shù)字顯示式注射器泵:Perfusor Compact B.Braun;血糖儀:sure step強生（中國）醫(yī)療器材有限公司;大鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒:美國chemicon公司;大鼠腫瘤壞死因子-αELISA試劑盒:晶美公司;總RNA提取試劑異硫氰酸胍(TriozolReagent):美國Invitrogen Life technologies公司;目的基

4、因引物:大連寶生物公司;DNA MARKER DL2000:大連寶生物公司;RT-PCR試劑盒:大連寶生物公司;Protein A標記的瓊脂糖凝膠:碧云天公司; PPARα、 PPARγ抗體:santa cruz公司;堿性磷酸酶標記的二抗:北京中山生物技術(shù)有限公司。
　　 2、方法
　　 1)胰島素抵抗動物模型的建立
　　 健康雄性Wistar大鼠60只（購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心），體重140-200g。適應(yīng)

5、性喂養(yǎng)1周后按體重隨機分為2組，正常對照組(NC組)12只，高脂飼料組(HE組)48只。正常對照組給予普通標準大鼠飼料（由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供），其熱量組成:碳水化合物占63.4％，脂肪占16.2％，蛋白質(zhì)占20.4％。高脂飼料:參考文獻報道自行配制，其熱量組成為，碳水化合物占20％，脂肪占59％，蛋白質(zhì)占21％。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6只。動物房溫度保持在20～24C，濕度在55％～65％，自由光照。實驗期間大鼠可自由攝取食物和水

6、，每日添加飼料和飲水，每周稱重一次。連續(xù)喂養(yǎng)6周，之后將高脂喂養(yǎng)大鼠再根據(jù)體重隨機分為4組（每組12只）。其中一組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，另外3組在高脂飼料基礎(chǔ)上給予藥物干預(yù)。
　　 所有實驗動物共分為以下5組:正常對照組(NC)，高脂飼料組(HF)，非諾貝特（微粒化力平之）組(F)，替米沙坦（美卡素）組(T)，非諾貝特與替米沙坦聯(lián)合組(F+T)。非諾貝特和替米沙坦分別以30mg/kg體重和4mg/kg體重的劑量給予。每周調(diào)整一次藥物

7、劑量。藥物每周配制一次，冰箱中保存，灌胃方式給藥，每日一次。
　　 2)正常葡萄糖高胰島素鉗夾技術(shù)對胰島素抵抗大鼠模型的評價
　　 第4周末給藥處理結(jié)束時，隨機從每一實驗組中選取大鼠4只做葡萄糖鉗夾實驗研究。實驗前大鼠禁食12小時過夜，但仍可自由飲水。第二天上午8時進行葡萄糖鉗夾。10％水合氯醛300mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后，仰臥位固定大鼠，燈照以保持大鼠體溫。行頸部正中切口分離右頸靜脈和左頸動脈，分別插入兩枚Y型

8、靜脈留置針，縫合線充分固定。頸靜脈通路用于輸注胰島素和葡萄糖，頸動脈通路用于取血標本檢測葡萄糖濃度。頸動脈導(dǎo)管則接一裝有肝素生理鹽水(濃度為5(O)U/ml)的注射器進行抗凝。葡萄糖和胰島素輸注速率由微電腦數(shù)字顯示式注射器泵控制。
　　 手術(shù)完畢后先靜止30分鐘，再抽取動脈血0.5ml測定基礎(chǔ)血糖和血清胰島素水平，然后以恒定速度輸注胰島素，其速率為4mU/kg·min，每間隔5分鐘采血一次，用自動血糖儀測定葡萄糖濃度，當血糖低于

9、基礎(chǔ)血糖值時開始輸注10％的葡萄糖溶液。葡萄糖輸注速率從5mg/kg·min開始，根據(jù)血糖值調(diào)整葡萄糖輸注速率，使血糖值保持在基礎(chǔ)血糖(mmol/L)±0.5mmol/L范圍。當連續(xù)3次血糖值均在上述范圍時即達到了穩(wěn)定狀態(tài)。記錄后一小時13次葡萄糖輸注速率，取其平均值即為葡萄糖輸注率(glucose infusion rate，GIR)。
　　 3)空腹血糖測定
　　 各組大鼠干預(yù)處理后采用血糖儀檢測清晨空腹鼠尾血糖。<

10、br>　　 4)大鼠血壓測定
　　 干預(yù)處理后每組各取出4只大鼠進行有創(chuàng)性頸動脈血壓測定。
　　 5)血液標本的采集
　　 大鼠禁食12小時后，10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，立即剪開大鼠腹部皮膚，抽取下腔靜脈血液，立即于4℃恒溫下、2500rpm離心10分鐘，取其血清分裝于1.0mlEP管中-40℃冰箱內(nèi)保存待用。
　　 6)鼠內(nèi)臟標本的采取
　　 大鼠處死后，立即取出大鼠附睪脂肪、腎周圍脂肪、

11、肝臟。用濾紙吸干后稱重，標本于液氮中速凍后，置于-80℃冰箱中保存待用。
　　 7)血清學參數(shù)檢測
　　 甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定，采用日立全自動生化儀(7600-110)。
　　 血清胰島素濃度測定，采用胰島素放射免疫分析藥盒（北京原子高科股份有限公司）。
　　 血清游離脂肪酸測定，采用游離脂肪酸試劑盒（南京建成生物工程研

12、究所）。
　　 血清脂聯(lián)素和腫瘤壞死因子-α濃度測定，采用ELISA試劑盒（美國chemicon公司，晶美公司）。
　　 8) mRNA表達檢測
　　 采用RT-PCR方法檢測附睪脂肪中PPARγ、抵抗素和脂聯(lián)素mRNA表達，檢測肝臟中PPARαmRNA表達。
　　 9)蛋白質(zhì)表達的檢測
　　 采用Western方法測定肝臟PPARα蛋白的表達、附睪脂肪PPARγ蛋白的表達。
　　 實驗結(jié)

13、果：
　　 1、與CN組相比較，HF組大鼠體重逐漸增加，從第4周開始顯示出兩組間的統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，這種差異持續(xù)存在至實驗結(jié)束。HF組空腹血糖、胰島素濃度、甘油三酯、游離脂肪酸明顯高于CN組(P＜0.01)，GIR于HF組明顯低于CN組(P＜0.01)。
　　 2、藥物干預(yù)后F組、T組和TF組大鼠的體重與HF組相比較均明顯減輕(P＜0.01);三組大鼠的GIR與HF組相比較獲得明顯改善(P＜0.01);三組大鼠

14、血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平均有不同程度的下降、高密度脂蛋白膽固醇增高，與HF組大鼠相比較差異性顯著(P＜0.05);高脂組大鼠血清脂聯(lián)素降低(P＜0.05)、血清腫瘤壞死因子濃度明顯升高(P＜0.01)，藥物干預(yù)后，與HF組相比較，聯(lián)合治療組脂聯(lián)素升高最為明顯，P＜0.01;三個干預(yù)組的腫瘤壞死因子-α濃度明顯下降，P＜0.05或P＜0.01;HF組大鼠的血壓水平明顯升高，P＜0.01;F組大鼠的血壓也有所升高，與N

15、C組大鼠比較，P＜0.05。
　　 3、HF組大鼠PPARα和PPARγ mRNA表達明顯下降，與NC組相比較，P＜0.01;藥物干預(yù)后，F(xiàn)組和TF組PPARαmRNA表達明顯明顯增加，與HF組相比較，P＜0.01，T組則無明顯變化;T組和F+T組PPARγ mRNA表達顯明顯增加，與HF組相比較，P＜0.01，而F組則無明顯變化。
　　 4、PPARα和PPARγ蛋白表達變化趨勢與其mRNA表達變化相類似。Resist

16、inmRNA表達在HF組最低，與NC組相比較，P＜0.01;F組、T組和F+T組的表達均增加，P＜0.05;與HF組相比較差異性顯著，P＜0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1、高脂飼料喂養(yǎng)可建立具有臨床代謝綜合征基本特征的大鼠實驗動物模型。
　　 2、非諾貝特和替米沙坦均能夠改善胰島素抵抗大鼠的胰島素抵抗狀態(tài)，兩者聯(lián)合應(yīng)用對某些代謝指標的異常有進一步的改善作用。
　　 3、非諾貝特可使胰島素抵抗大鼠的血壓有

17、所升高，替米沙坦能夠抑制其升高血壓的不利作用。
　　 4、非諾貝特和替米沙坦在改善胰島素抵抗同時對細胞因子有調(diào)節(jié)作用，非諾貝特和替米沙坦聯(lián)合應(yīng)用能額外增加血清脂聯(lián)素水平。
　　 5、胰島素抵抗可使肝臟細胞PPARαmRNA表達下降，非諾貝特可使PPARαmRNA表達增強，附睪脂肪PPARγ mRNA表達在胰島素抵抗時也明顯下降，替米沙坦能恢復(fù)其mRNA表達。
　　 6、菲諾貝特和替米沙坦通過PPARα和 PPAγ