七氟烷缺血后處理的離體大鼠心肌保護(hù)作用與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔和三磷酸腺苷敏感性鉀離子通道相關(guān)性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究.pdf

1、目的：采用Langendorff離體大鼠心臟灌注模型，觀察七氟烷缺血后處理(IPO)對(duì)大鼠心肌的保護(hù)作用，研究七氟烷IPO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白激酶B(PKS/Akt)-糖原合成激酶3β(GSK3 β)對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)和線粒體鉀離子敏感性三磷酸腺苷通道(mKATP通道)影響，探討mKATP通道和mPTP作用的相關(guān)性。 方法：120只雄性Wistar大鼠，體重270g～325g，隨機(jī)分為8組，每組15只。8組分別為：C

2、ontrol組(空白對(duì)照，不加任何干擾因素)、ISCH組(心肌缺血未行保護(hù)措施)、ISCH+ATR組(心肌缺血+蒼術(shù)甙(ATR))、ISCH+5-HD組(心肌缺血+5-羥癸酸(5-HD))、Vehicle組(心肌缺血+溶劑二甲亞砜(DMS0))、IPO組(心肌缺血+七氟烷缺血后處理)、IPO+5-HD組(心肌缺血十七氟烷IPO+5-HD)、IPO+ATR(心肌缺血+七氟烷IPO+5-ATR)。2.5％戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注

3、射麻醉后，股靜脈注射肝素1000 U/kg抗凝。開胸，取下心臟放入4℃改良Krebs-Henseleit(K-H)液中，主動(dòng)脈插管懸掛心臟于Langendorff灌流裝置上，用K-H緩沖液行主動(dòng)脈逆行灌流(灌注壓為10.67 kPa)。連接壓力換能器至PowerLab多導(dǎo)生理監(jiān)測(cè)儀，以Chart 5 forWindows軟件實(shí)時(shí)觀察并分析左室發(fā)展壓(LVDP)、左心室壓力上升變化最大速率(+dP/dtmax)、心率(HR)。記錄平衡20

4、 min、再灌注15 min和60 min冠脈流量，并保存心肌灌注流出液。K-H緩沖液灌注自主跳動(dòng)的心臟20 min，以達(dá)到平衡的目的(baseline)，繼之以停灌注40 min以達(dá)到實(shí)驗(yàn)性缺血(global ischemia)的目的。Control組未行其他處理，只是時(shí)間匹配。ISCH組全心缺血40min，未給其它干預(yù)措施。ISCH+ATR組再灌注伊始給予ATR 20μM/L，15 min后復(fù)灌45 min。ISCH+5HD組再灌注

5、伊始給予5-HD 15μM/L，15 min后復(fù)灌45 min。Vehicle組全心缺血40 min后給予DMSO，15 min后復(fù)灌45 min。IPO組在復(fù)灌起始階段，給予七氟烷1.0 MAC(2.0vol1％)15 min行麻醉藥缺血后處理。七氟烷通過Isotec 3麻醉氣體蒸發(fā)罐(Datex-Ohmeda)平衡緩沖液。以Datex氣體檢測(cè)儀持續(xù)監(jiān)測(cè)緩沖液中七氟烷濃度，以保證進(jìn)入主動(dòng)脈灌注液的七氟烷濃度維持在2.0％(vol/vo

6、l)(1.0 MAC，大鼠，37℃)。再灌注前10 min，將1.0 MAC七氟烷充入K-H液中，以飽和緩沖液。復(fù)灌15 min后更換無七氟烷K-H液續(xù)灌45 min。IPO+5-HD組和IPO+ATR組，為分別復(fù)合使用七氟烷+5-HD及復(fù)合使用七氟烷+ATR，方法同前。用2,3,5-氯三苯四唑(TTC)染色法確定心肌梗死區(qū)面積。用Image J 1.37行圖像分析，磚紅色為正常區(qū)域，灰白色為梗死區(qū)域。梗死面積由左室總壞死區(qū)占左室總切片

7、區(qū)的百分?jǐn)?shù)來界定。復(fù)灌60 min，取左心室組織石蠟包埋并切片，標(biāo)本行TUNEL染色，計(jì)算凋亡指數(shù)(Al)。分別在心臟灌流平衡20 min，再灌注60 min收集心臟流出液并測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌鈣蛋白1(cTnl)的濃度。采用組織勻漿法分離心肌細(xì)胞胞漿和線粒體。采用蛋白印跡分析(Western Blot)法分析B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(Bcl-2)、細(xì)胞色素C(Cyt C)的線粒體和胞漿含量、磷酸化

8、蛋白激酶B(p-PKB/Akt)和PKB/Akt的比率以及磷酸化-糖原合成激酶3 β(p-GSK3 β)和GSK3B的比率。 結(jié)果：由血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)可知，各組基礎(chǔ)值之間差異不顯著。和基礎(chǔ)值相比，缺血后的各組LVDP，±dp/dt，HR和CF均顯著性下降(P<0.05)。和對(duì)照組比，其它實(shí)驗(yàn)組的LVDP，±dp/dt，HR和CF均顯著性下降(P<0.05)。和七氟烷IPO組比，除對(duì)照組除外其它各組缺血后lNDP、±dp/dt、HR

9、和CF均顯著性下降(P<0.05）。和對(duì)照組比，ISCH組、IPO組復(fù)灌后心臟灌注流出液的LDH、CK-MB和cTnl均顯著升高(p<0.05)；和ISCH組比，IPO組復(fù)灌后心臟灌注流出液的LDH、CK-MB和cTnl均顯著降低(p<0.05)。和基礎(chǔ)值比，對(duì)照組K-H液灌流120 min的LDH、CK-MB和cTnl未發(fā)現(xiàn)顯著變化(p>0.05)，ISCH和IPO組復(fù)灌60min的LDH、CK-MB和cTnl均顯著升高(p<0.05

10、)。Control組。TTC染色未見明顯的梗死區(qū)。與ISCH組比，各實(shí)驗(yàn)組的TTC染色顯示的梗死區(qū)占左室總面積的百分?jǐn)?shù)顯著升高(P<0.05)。和ISCH比，Control組、IPO組和IPO+5-HD組的AI顯著降低(P<0.05)；和Control組比，其它實(shí)驗(yàn)組的Al值均顯著增高(P<0.05)；和IPO比，除Control組外其它各組Al值顯著升高(P<0.05)。和Control組比，除Vehicle和IPO組外，其它各組Bc

11、l-2值均顯著性下降(P<0.05)；和ISCH組比，Control、Vehicle和IPO組值顯著上升(P<0．05)；和IPO組比，除Control組外，其它各組均顯著降低(P<0．05)。和Control比，除IPO組外，其它各組線粒體中的Cyt C含量均顯著性降低(P<0．05)；和ISCH比，Control組、IPO組和IPO+5-HD組線粒體中的Cyt C含量均顯著增高(P<0．05)；和IPO比，Control組線粒體的C

12、yt C值顯著增高(P<0．05)，而其它各實(shí)驗(yàn)組線粒體中的Cyt C含量顯著下降(P<0．05)。和Control比，各試驗(yàn)組胞漿中Cyt C含量均顯著性升高(P<0．05)；和ISCH比，Control組、IPO組和IPO+5-HD組胞漿中的Cyt C含量均顯著降低(P<0．05)；和IPO比，Control組線粒體的Cyt C值顯著降低(P<0．05)，其它各實(shí)驗(yàn)組胞漿中的Cyt C含量顯著上升(P<0．05)。和control組

13、比，其它實(shí)驗(yàn)組的p-AKT／AKT比率顯著增高(P<0．05)；和ISCH組比，IPO組和IPO+5-HD組顯著增高。與Control組比，其它各實(shí)驗(yàn)組的P-GSK3B/GSK3B比率顯著升高(P<0．05)；與ISCH組比，ISCH+ATR和IPO+ATR顯著降低P<0．05)，而IPO和IPO+5-HD顯著上升P<0．05)。 結(jié)論：七氟烷缺血后處理對(duì)離體大鼠心肌有保護(hù)作用；七氟烷缺血后處理可減輕心肌細(xì)胞凋亡和壞死；PKB/