白花丹醌對(duì)肝纖維化HSEC結(jié)構(gòu)及分泌功能干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　觀察白花丹的藥用活性成分白花丹醌對(duì)HSEC細(xì)胞的作用，了解該藥對(duì)HSEC細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)及分泌功能的影響，觀察該藥對(duì)肝竇毛細(xì)血管化及纖維化相關(guān)因子表達(dá)水平的干預(yù)，并進(jìn)一步探究其抗肝纖維化及活血化瘀的藥理作用及靶位點(diǎn)。為白花丹的抗肝纖維化作用提供重要的科學(xué)依據(jù)，為開發(fā)利用盛產(chǎn)于廣西的民族藥白花丹治療肝纖維化作出理論和實(shí)驗(yàn)的鋪墊。
　　第一部分
　　方法：
　?。?）動(dòng)物模型：二甲基亞硝胺、小牛血清白蛋白和

2、去甲腎上腺素注射液聯(lián)合注射，外加乙醇灌胃及高脂低蛋白飼料喂養(yǎng)，多因素聯(lián)合構(gòu)建血瘀證肝纖維化模型。造模結(jié)束觀察大鼠的死亡率、中醫(yī)血瘀證證候、證候等級(jí)評(píng)分、肝臟病理學(xué)大體形態(tài)、肝功能改變，以及免疫組化法染色觀察I型和III型膠原、α-SMA三種膠原蛋白的表達(dá)水平、放射酶免法血清學(xué)檢測(cè)大鼠肝纖維化四項(xiàng)——HA、P3NP、LN、CⅣ的含量。將以上結(jié)果與傳統(tǒng)CCl4單因素造模法進(jìn)行比較。
　?。?）細(xì)胞模型：膠原酶灌注分離、梯度離心純化及培

3、養(yǎng)大鼠HSEC細(xì)胞株。
　　結(jié)果：
　　（1）動(dòng)物模型：①?gòu)?fù)合多因素模型組大鼠的死亡率為20％；②模型大鼠出現(xiàn)瘀斑、舌紫暗、便溏等典型的中醫(yī)血瘀證證候，血瘀證證候等級(jí)評(píng)分高；③病理學(xué)大體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)表面暗白、密布灰白結(jié)節(jié)、質(zhì)硬脆等纖維樣變化；④血清學(xué)肝功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型大鼠的ALT和AST，以及TBIL、DBIL及IBIL的含量均顯著上升；⑤免疫組化法染色發(fā)現(xiàn)I型和III型膠原、α-SMA三種膠原蛋白的表達(dá)水平顯著增高

4、；⑥大鼠的血清肝纖維化四項(xiàng)——HA、P3NP、LN、CⅣ的含量均顯著上升。⑦血瘀證模型組的以上各項(xiàng)結(jié)果(除了死亡率及肝功能外)經(jīng)對(duì)比均高于CCl4模型組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均有差異(p<0.05)。
　　（2）細(xì)胞模型：掃描電鏡及透射電鏡觀察到細(xì)胞株的血竇、窗孔、基底膜等HSEC的特異性結(jié)構(gòu)；CK19單抗免疫熒光法鑒定第Ⅲ代培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)紅色熒光物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，95%以上的細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)顯示CK19陽(yáng)性。
　　

5、結(jié)論：
　　（1）復(fù)合多因素造模方法能有效地改善CCl4造模法的高死亡率缺點(diǎn)；模型動(dòng)物同時(shí)具備了疾病與證候雙重特征，既符合中醫(yī)血瘀證證候的基本特點(diǎn)，又與西醫(yī)肝纖維化病理特征相一致。
　?。?）血竇、窗孔、基底膜等HSEC的特異性結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，以及CK19單抗免疫熒光法鑒定結(jié)果均表明，從大鼠肝組織中分離得并培養(yǎng)的細(xì)胞確是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，且純度較高。
　　第二部分
　　方法：
　　以病證結(jié)合肝纖維化大鼠（動(dòng)物模型）

6、及瘦素激活的HSEC（細(xì)胞模型）作為研究模型，以高、中、低濃度白花丹醌作為干預(yù)對(duì)象，以秋水仙堿和丹參酚酸B作為陽(yáng)性對(duì)照。動(dòng)物模型藥物干預(yù)2wk，細(xì)胞模型藥物孵育48h后，分別制作組織和細(xì)胞電鏡標(biāo)本；掃描電鏡觀察HSEC細(xì)胞的血竇和窗孔的開放情況；透射電鏡觀察細(xì)胞窗孔的開放數(shù)量及面積，以及細(xì)胞外基底膜的形成情況。
　　結(jié)果：
　　（1）肝纖維化的病變程度與窗孔的數(shù)量及面積成反比關(guān)系；肝纖維化程度越高，窗孔數(shù)量越少，孔徑越??；而

7、肝纖維化程度越高，基底膜的形成越完整，甚至連接成片。
　　（2）白花丹醌能使關(guān)閉或消失了的窗孔明顯增多，孔徑增大；使細(xì)胞外基質(zhì)沉積形成的基底膜變薄和減少，從而降低了肝竇內(nèi)皮毛細(xì)血管化的程度。并且上述干預(yù)作用呈現(xiàn)白花丹醌的藥物劑量依賴性。
　　結(jié)論：
　　肝纖維化的病變程度與窗孔的數(shù)量、面積及基底膜的形成有直接相關(guān)性；民族藥白花丹醌能夠通過使窗孔明顯增多和增大，使細(xì)胞外基底膜變薄和減少，降低肝竇內(nèi)皮毛細(xì)血管化的程度，以此

8、為靶點(diǎn)改善肝臟的微循環(huán)障礙，進(jìn)而使肝纖維化程度明顯降低。并發(fā)現(xiàn)白花丹醌在一定范圍的濃度內(nèi)，給藥劑量越高，干預(yù)肝竇內(nèi)皮毛細(xì)血管化進(jìn)程的能力越強(qiáng)。
　　第三部分
　　方法：
　　培養(yǎng)HSEC細(xì)胞株并分為7組：空白對(duì)照組(A組)、瘦素激活細(xì)胞模型組(B組)、白花丹醌高濃度組(C1組)、中濃度組(C2組)、低濃度組(C3組)、秋水仙堿陽(yáng)性對(duì)照組(D組)、丹參酚酸B陽(yáng)性對(duì)照組(E組)。培養(yǎng)孵育48h后，用免疫熒光法檢測(cè)ET-1、

9、VEGF、ColⅣ和LN四種肝纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子在各組HSEC細(xì)胞上的表達(dá)定位、范圍及強(qiáng)度；用RT-PCR法檢測(cè)HSEC的上述四個(gè)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平（轉(zhuǎn)錄水平）；用ELISA法檢測(cè)HSEC的上述四個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)水平（蛋白翻譯水平）。
　　結(jié)果：
　?。?）免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，源自HSEC細(xì)胞的ET-1和VEGF兩種蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上，表達(dá)均勻而彌散；而ColⅣ和LN兩種蛋白的表達(dá)除了在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，較

10、多的位于細(xì)胞膜周圍密集表達(dá)。
　?。?）與空白對(duì)照組（A組）相比，B、C1、C2、C3、D和E各干預(yù)組的HSEC細(xì)胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四種細(xì)胞因子的熒光顯色的范圍及強(qiáng)度、mRNA的表達(dá)水平、蛋白的表達(dá)水平均有明顯上升；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　?。?）瘦素激活模型組（B組）HSEC細(xì)胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四種細(xì)胞因子的熒光顯色的范圍及強(qiáng)度、mRNA的表達(dá)水平、蛋白的表達(dá)水平較A組

11、相比均出現(xiàn)明顯增高，而且上述表達(dá)水平在各組中均處于最高；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異均有高度顯著性(p<0.01)。
　?。?）C1、C2、C3、D和E各藥物干預(yù)組HSEC細(xì)胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四種細(xì)胞因子，其熒光顯色的范圍及強(qiáng)度、mRNA的表達(dá)水平、蛋白的表達(dá)水平與瘦素激活模型組（B組）相比均有明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(p<0.01)，可見各藥物對(duì)HSEC細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯的干預(yù)均出現(xiàn)了明顯的效果。
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12、5）白花丹醌高、中、低劑量組（C1、C2、C3組）HSEC細(xì)胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四種細(xì)胞因子的熒光顯色的范圍及強(qiáng)度、mRNA的表達(dá)水平、蛋白的表達(dá)水平較B組相比均出現(xiàn)了明顯降低（但仍高于正常對(duì)照A組），p<0.05；而且隨著給藥濃度上升，可觀察到C3、C2、C1組各蛋白的上述表達(dá)水平均出現(xiàn)了梯度下降(p<0.05)，可見藥物白花丹醌抑制HESC細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯的作用有劑量依賴性。
　?。?）陽(yáng)性藥物

13、對(duì)照D組和E組HESC細(xì)胞的ET-1、VEGF、ColⅣ和LN四種細(xì)胞因子，其熒光顯色的范圍及強(qiáng)度、mRNA的表達(dá)水平、蛋白的表達(dá)水平與瘦素激活模型組（B組）相比，均有明顯降低(p<0.01)；但是高劑量白花丹醌組（C1組）的上述表達(dá)水平均明顯低于D組和E組(p<0.05)，可見高劑量的白花丹醌對(duì)HESC纖維化細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的干預(yù)強(qiáng)度大于治療劑量的秋水仙堿和丹參酚酸B。
　　結(jié)論：
　?。?）民族藥白花丹醌可以在轉(zhuǎn)錄