高鹽和高脂對CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟NKCC2的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 細(xì)胞色素P4504F2(cytochrome P4504F2，CYP4F2)編碼的ω-羥化酶，可將花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)代謝生成二十羥基二十碳四烯酸（20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE）。20-HETE一方面通過阻斷Ca2+激活的鉀通道收縮外周小動脈;另一方面通過抑制腎臟近曲小管和髓袢升支粗段的Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPas

2、e)、Na+/H+交換體(NHE3)、70pS+鉀通道(ROMK)和Na+-K+-2Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體(NKCC2; SLC12Al)，抑制腎臟水鈉重吸收。前期本課題組成功的建立了CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠，并證明轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟CYP4F2蛋白表達(dá)增加、20-HETE合成增多、呈高血壓表型，推測在正常飲食情況下20-HETE主要表現(xiàn)收縮血管的促高血壓作用。為了闡明20-HETE對腎臟水鈉代謝的調(diào)節(jié)作用，我們以CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象進(jìn)行

3、高鹽飼料喂養(yǎng)，并錨定腎臟NKCC2蛋白，深入探討20-HETE與高鹽交互作用對腎臟水鈉代謝的具體機(jī)制。
　　 代謝綜合征主要表現(xiàn)為高血壓、高血糖、高血脂和肥胖，然而關(guān)于代謝綜合征患者血壓升高的具體機(jī)制尚不清楚。許多學(xué)者預(yù)測肥胖導(dǎo)致近曲小管、髓袢升支粗段和遠(yuǎn)端小管水鈉重吸收增強(qiáng)是引起血壓升高的潛在原因。由于20-HETE在近曲小管和髓袢升支粗段發(fā)揮抑制腎臟水鈉重吸收的利尿鈉作用，因此我們推測20-HETE可能參與了代謝綜合征患者的

4、血壓調(diào)節(jié)。Dorrance等用高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠10周，發(fā)現(xiàn)腎臟CYP4A蛋白表達(dá)減少，推測是由于其功能性代謝產(chǎn)物20-HETE合成減少導(dǎo)致機(jī)體水鈉潴留，引起血壓增高;Wang等以Clofibrate（氯貝丁酯）誘導(dǎo)20-HETE合成增加可減輕高脂飲食引起的水鈉潴留和血壓升高，證實(shí)了我們及Dorrance的推測，可見，20-HETE在代謝綜合征中發(fā)揮著重要的血壓調(diào)節(jié)作用。因此，本研究利用高脂飼料喂養(yǎng)CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠，借助其高水平

5、的20-HETE背景，圍繞腎臟NKCC2蛋白，探討20-HETE與高脂協(xié)同調(diào)節(jié)NKCC2的具體機(jī)制。
　　 本研究憑借CYP4F2轉(zhuǎn)基因小鼠模型這一研究平臺，分別用高鹽、高脂飼料喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小鼠，旨在深入探討不同水平20-HETE遺傳背景與環(huán)境因素（高鹽/高脂）相互作用對血壓的調(diào)節(jié)作用及具體機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料:
　　 1.FVB/N小鼠
　　 2.人HEK-293細(xì)胞系<

6、br>　　 3.Real-time PCR相關(guān)試劑
　　 4.Western blot、免疫組化及免疫共沉淀相關(guān)試劑
　　 5.基因克隆及螢光素酶報(bào)告基因檢測相關(guān)試劑
　　 6.刺激藥物:HET0016、MG132、羅格列酮
　　 7.LC/MS相關(guān)試劑
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.無創(chuàng)鼠尾血壓儀測量小鼠收縮壓，生化檢測儀檢測小鼠24小時尿鈉，LC/MS檢測小鼠24小時尿20-HET

7、E。
　　 2.提取小鼠腎臟總蛋白并定量，Western blot檢測高鹽飼料喂養(yǎng)及應(yīng)用HET0016刺激的轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟NKCC2蛋白表達(dá)。
　　 3.4％多聚甲醛固定腎臟組織塊，石蠟切片，免疫熒光鑒定NKCC2的表達(dá)及定位。
　　 4.提取高鹽飼料喂養(yǎng)小鼠腎臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并通過Real-timePCR檢測腎臟NKCC2 mRNA表達(dá)。
　　 5.免疫沉淀方法比較高鹽飼料喂養(yǎng)前后轉(zhuǎn)基因與

8、野生型小鼠腎臟NKCC2蛋白泛素化修飾情況。
　　 6.腎臟組織勻漿液與熒光標(biāo)記的蛋白酶體底物多肽Suc-LLVY-AMC共同孵育，多功能酶標(biāo)儀檢測蛋白酶體活性。
　　 7.MG132腹腔注射高鹽飼料喂養(yǎng)的小鼠3天，Western blot檢測腎臟NKCC2蛋白變化，免疫共沉淀方法檢測NKCC2蛋白泛素化水平變化。
　　 8.免疫共沉淀方法鑒定NKCC2蛋白與泛素連接酶E3 Nedd4-2蛋白之間的相互作用。

9、r>　　 9.Real-time PCR檢測高脂飼料喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠腎臟NKCC2 mRNA表達(dá)。
　　 10.Western blot檢測高脂飼料喂養(yǎng)前后轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠腎臟PPAR-γ蛋白表達(dá)情況。
　　 11.利用生物信息學(xué)軟件分析小鼠NKCC2基因啟動子結(jié)構(gòu)，構(gòu)建NKCC2基因啟動子區(qū)系列截短的螢光素酶報(bào)告基因重組體，應(yīng)用雙螢光素酶活性檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性。
　　 12.雙螢光素酶活性檢測系統(tǒng)

10、檢測PPAR-γ對NKCC2基因啟動子活性的影響。
　　 13.Western blot檢測高脂飼料喂養(yǎng)前后轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠腎臟NKCC2蛋白表達(dá)情況。
　　 14.免疫沉淀方法比較高脂飼料喂養(yǎng)前后轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠腎臟NKCC2蛋白泛素化修飾情況。
　　 結(jié)果:
　　 一、20-HETE與高鹽交互作用經(jīng)泛素蛋白酶體調(diào)節(jié)NKCC2表達(dá)的機(jī)制研究
　　 1.高鹽飼料喂養(yǎng)后野生型小鼠血壓明顯升高，而

11、轉(zhuǎn)基因小鼠血壓無明顯變化。高鹽使小鼠尿鈉排泄增加，其中轉(zhuǎn)基因小鼠增加程度明顯高于野生型小鼠。另外，高鹽使小鼠尿20-HETE排泄增加，且轉(zhuǎn)基因小鼠尿20-HETE排泄始終高于野生型小鼠。
　　 2.高鹽飼料喂養(yǎng)后，轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟NKCC2蛋白豐度下降了85％，野生型小鼠下降了24％。高鹽飼料喂養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用20-HETE合成抑制劑HET0016后腎臟NKCC2蛋白的表達(dá)明顯回升，說明20-HETE和高鹽協(xié)同參與NKCC2蛋白

12、的負(fù)調(diào)控作用。
　　 3.Real-time PCR檢測小鼠腎臟NKCC2 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高鹽飼料喂養(yǎng)后小鼠腎臟NKCC2 mRNA與蛋白的變化趨勢不一致。
　　 4.免疫沉淀結(jié)合Western blot結(jié)果表明20-HETE與高鹽協(xié)同作用誘導(dǎo)小鼠腎臟NKCC2蛋白發(fā)生泛素化修飾。
　　 5.蛋白酶體活性抑制劑MG132恢復(fù)了高鹽導(dǎo)致的腎臟NKCC2蛋白的減少，并增加了NKCC2的泛素化水平，說明泛素化NKC

13、C2蛋白是經(jīng)由蛋白酶體途徑降解。
　　 6.免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)NKCC2蛋白與Nedd4-2蛋白存在相互作用，說明Nedd4-2是誘導(dǎo)NKCC2泛素化的泛素連接酶E3。
　　 二、20-HETE與高脂交互作用介導(dǎo)PPAR-γ調(diào)節(jié)NKCC2轉(zhuǎn)錄的機(jī)制研究
　　 1.高脂使NKCC2 mRNA表達(dá)顯著增加，其中轉(zhuǎn)基因小鼠增加的程度明顯高于同組野生型小鼠，說明20-HETE與高脂協(xié)同作用對NKCC2基因存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

14、。
　　 2.高脂誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠腎臟PPAR-γ蛋白表達(dá)，推測20-HETE與高脂協(xié)同作用通過PPAR-γ調(diào)控NKCC2基因表達(dá)。
　　 3.PPAR-Y激動劑羅格列酮可有效地上調(diào)NKCC2基因的轉(zhuǎn)錄活性，另外，通過構(gòu)建系列截短N(yùn)KCC2啟動子螢光素酶報(bào)告基因載體，我們將PPAR-γ潛在的反應(yīng)元件定位于-1462～-1098bp之間。
　　 4.高脂喂養(yǎng)后，小鼠腎臟NKCC2蛋白表達(dá)減少，并且轉(zhuǎn)基因小鼠顯著低于野

15、生型小鼠。
　　 5.免疫沉淀和免疫共沉淀結(jié)果表明，高脂使腎臟NKCC2蛋白發(fā)生泛素化修飾，并且轉(zhuǎn)基因小鼠泛素化程度顯著高于野生型小鼠。Nedd4-2是誘導(dǎo)NKCC2泛素化的泛素連接酶E3。
　　 結(jié)論:
　　 1.20-HETE與高鹽協(xié)同作用，通過泛素連接酶E3 Nedd4-2介導(dǎo)腎臟NKCC2蛋白泛素化修飾，并經(jīng)蛋白酶體系統(tǒng)降解。
　　 2.20-HETE與高脂協(xié)同作用，一方面通過PPAR-γ調(diào)節(jié)NK