基于人腸道菌群代謝系統(tǒng)從九節(jié)龍?jiān)碥?Ⅰ代謝物中篩選抗腫瘤活性物質(zhì)的研究.pdf

1、研究背景：
　　腸道菌對(duì)人類的健康和疾病有著重要的影響，除了可以分解人體的營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、產(chǎn)生機(jī)體需要的維生素外，某些腸道菌群的失調(diào)可能會(huì)引發(fā)疾病，增加機(jī)體患病的概率。研究顯示，腸道菌對(duì)藥物也具有很強(qiáng)的代謝能力。目前，從藥物的腸道菌代謝物中尋找潛在生物活性物質(zhì)已成為新藥研發(fā)的新領(lǐng)域。傳統(tǒng)中藥最常用的給藥方式為口服給藥，口服藥物在體內(nèi)會(huì)不可避免的受到腸道菌的影響。許多天然產(chǎn)物經(jīng)腸道菌群的代謝后，可轉(zhuǎn)化成具有藥理活性的物質(zhì)，尤

2、其是具有水溶性糖苷類天然產(chǎn)物。這類化合物因其分子量和極性較大，在腸內(nèi)滯留時(shí)間較長而易受到腸道菌群的作用，經(jīng)腸道菌群代謝后生成次生苷或苷元而發(fā)揮其藥理作用。大量研究表明，天然產(chǎn)物的腸道菌代謝產(chǎn)物才是真正到達(dá)靶器官發(fā)揮藥理作用的活性物質(zhì)。
　　九節(jié)龍?jiān)碥?Ⅰ（Ardipusilloside-Ⅰ, ADS-Ⅰ）是從川產(chǎn)九節(jié)龍（Ardisiapusill A.DC）全草中提取出來的一種三萜皂苷，具有溶血性，無法通過靜脈給藥，而口服給藥，在

3、大鼠血漿中無法檢測到，其腸道吸收差，生物利用度低，這已成為研發(fā)ADS-Ⅰ等皂苷類藥物的瓶頸。前期研究表明，ADS-I在體內(nèi)外均有良好的抗癌活性，且口服給藥對(duì)多種實(shí)體瘤均有顯著的抑制作用。本課題組研究發(fā)現(xiàn)ADS-Ⅰ幾乎不能被大鼠胃腸道吸收，吸收進(jìn)入大鼠體內(nèi)的物質(zhì)為其脫糖基的代謝產(chǎn)物。所有這些研究提示ADS-Ⅰ的腸道菌代謝產(chǎn)物可能才是對(duì)多種實(shí)體瘤發(fā)揮抑制作用的真正物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　本課題模擬人腸道菌群代謝系統(tǒng)，結(jié)合人腸膜Caco-2細(xì)胞

4、吸收轉(zhuǎn)運(yùn)模型，通過液質(zhì)聯(lián)用和液核聯(lián)用等分析技術(shù)進(jìn)行ADS-Ⅰ代謝產(chǎn)物的分離、鑒定與富集，并對(duì)分離出的新化合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性檢測，并初步考察其細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方式，探索ADS-Ⅰ口服給藥在體內(nèi)抗腫瘤作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為尋找新的生物活性物質(zhì)提供思路和方案。
　　研究目的：
　　分離、鑒定和富集ADS-Ⅰ經(jīng)人腸道菌群代謝后的活性產(chǎn)物，并對(duì)其體外抗腫瘤活性及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)行初步探討。
　　研究方法：
　　1.離體培養(yǎng)人腸道

5、菌對(duì) ADS-Ⅰ進(jìn)行代謝研究，應(yīng)用高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）和超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測器（UHPLC-MS）等分析技術(shù)檢測并推斷ADS-Ⅰ系列代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
　　2.采用葡聚糖凝膠LH-20柱層析法富集ADS-Ⅰ代謝產(chǎn)物，并通過NMR和MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。MTT法初步考察ADS-Ⅰ及其代謝物對(duì)人肝癌細(xì)胞（SMMC-7721）和人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）生長抑制率。
　　3.建立Caco-2細(xì)胞模型，采用

6、MTT法測定ADS-I及其代謝物對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性，從而篩選出用于滲透吸收的最佳藥物濃度，接著進(jìn)行藥物的雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，通過 UHPLC-MS法對(duì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的藥量進(jìn)行測定，根據(jù)公式計(jì)算藥物的表觀滲透系數(shù)，從而評(píng)價(jià)ADS-Ⅰ及其代謝物的腸吸收能力。
　　研究結(jié)果：
　　1. ADS-Ⅰ在人腸道菌群的生物轉(zhuǎn)化下產(chǎn)生4種代謝產(chǎn)物，主要發(fā)生脫糖基反應(yīng)，初步推斷其結(jié)構(gòu)分別為3個(gè)次生苷（M1、M2、M3）和1個(gè)苷元（M4）。

7、>　　2.通過葡聚糖凝膠LH-20柱層析法分離得到ADS-I的2種代謝產(chǎn)物（M1和M2），綜合核磁共振（NMR）和質(zhì)譜（MS）數(shù)據(jù)分析，確定M1為3-O-[α-L-鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)]-α-L-阿拉伯糖-西克拉敏 A，M2為3-O-[β-D-吡喃葡萄糖(1→3)]-α-L-阿拉伯糖-西克拉敏 A。
　　3. MTT研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)72 h時(shí) ADS-Ⅰ及代謝物 M1和 M2對(duì)人肝癌細(xì)胞（SMMC-77

8、21）的IC50值分別為5.48±0.47,9.65±0.62,40.91±1.27μmol/L，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）的IC50值分別為8.77±0.57,24.10±0.83,6.76±0.49μmol/L。結(jié)果表明，代謝物M2對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）抑制活性強(qiáng)于原化合物ADS-I。
　　4.利用Caco-2細(xì)胞模型對(duì)ADS-I及代謝M1和M2進(jìn)行吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究，120min時(shí)ADS-I從基頂側(cè)(AP)到基底側(cè)(BL)

9、及基底側(cè)(BL)到基頂側(cè)(AP)的表觀滲透系數(shù)Papp值分別為1.88±0.21×10-6cm·s-1、0.69±0.15×10-6cm·s-1。M1從AP側(cè)到BL側(cè)及BL側(cè)到AP側(cè)雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值分別為4.30±0.43×10-6 cm·s-1、1.76±0.26×10-6 cm·s-1，M2從AP側(cè)到BL側(cè)及BL側(cè)到AP側(cè)雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的Papp值分別為4.74±0.47×10-6 cm· s-1、2.12±0.23×10-6 cm·

10、s-1，且外排率（ER）均在0.3-0.6之間。結(jié)果表明，ADS-I通透性較差，口服吸收有限，其代謝物M1和M2具有良好的腸通透性。
　　研究結(jié)論：
　　本研究基于人腸道菌群代謝系統(tǒng)對(duì)ADS-Ⅰ進(jìn)行代謝研究，結(jié)果表明ADS-I在人腸道中主要以脫糖基方式進(jìn)行代謝且產(chǎn)生4種代謝產(chǎn)物，我們成功分離得到兩個(gè)新化合物（M1和M2）。研究發(fā)現(xiàn)代謝物M1和M2對(duì)人肝癌細(xì)胞（SMMC-7721）和人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）均有一定的抑制活性