基于“主客交”理論的加減三甲散對(duì)肝纖維化大鼠肝臟蛋白質(zhì)組影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　觀察加減三甲散治療肝纖維化的療效，并從蛋白質(zhì)組層面揭示其作用機(jī)制，探索“主客交”理論的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　SPF級(jí)Wistar雄性大鼠24只，隨機(jī)分成正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（復(fù)方鱉甲軟肝片）、加減三甲散組。常規(guī)飼養(yǎng)7d后給模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、加減三甲散組采用豬血清腹腔注射復(fù)制免疫性肝纖維化模型。造模后各組均灌胃給藥，1次/d，三甲散組劑量為8.125g·kg-1，鱉甲片組劑量為0.625g

2、·kg-1,模型組及正常組予0.9％生理鹽水等體積灌胃。治療60d后麻醉處死大鼠取肝臟，HE和MASSON染色觀察病理形態(tài)，免疫組化CD34標(biāo)記檢測(cè)肝臟微血管密度（MVD），ELLISA法檢測(cè)血清肝功能相關(guān)指標(biāo)、肝纖維化指標(biāo)，全自動(dòng)血液流變學(xué)檢測(cè)儀檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)，利用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)對(duì)四組大鼠肝臟進(jìn)行比較蛋白組學(xué)研究，Western blotting法驗(yàn)證部分差異蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.光

3、鏡下正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞未見(jiàn)變性及壞死，無(wú)明顯纖維結(jié)締組織增生。模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)脂肪或氣球樣變，大量纖維組織出現(xiàn)在中央靜脈至匯管區(qū)，有假小葉形成。加減三甲散組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞輕度腫脹，排列紊亂，少量纖維組織增生。與正常組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、加減三甲散組大鼠肝組織炎癥活動(dòng)度分級(jí)和纖維化程度分期及膠原纖維面積百分比均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、加減三甲散組肝組織炎癥活動(dòng)度分級(jí)和纖維化

4、程度分期及膠原纖維面積百分比均明顯降低（P＜0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組與加減三甲散組之間上述指標(biāo)比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　2.與正常組比較，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、加減三甲散組大鼠MVD水平顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、加減三甲散組MVD水平顯著下降（P＜0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組與加減三甲散組之間MVD水平比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　3.與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、GLB水平

5、均明顯升高（P＜0.05）；與模型組大鼠比較，加減三甲散組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清AST水平顯著下降，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清GLB水平顯著下降（P＜0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組與加減三甲散組之間大鼠血清AST、ALT、GLB、ALB及A/G水平比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　4.與正常組比較，模型組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平均明顯升高（P＜0.05），加減三甲散組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清PCⅢ、HA水平顯著升高（P＜0.05）；與模

6、型組比較，加減三甲散組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清HA、LN、PCⅢ水平明顯下降（P＜0.05）。
　　5.與正常組比較，模型組大鼠全血高切粘度(200S-1)、全血低切粘度(5S-1)、紅細(xì)胞壓積、血沉均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，三甲散組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠全血高切粘度(200S-1)、全血低切粘度(5S-1)、紅細(xì)胞壓積、血沉水平明顯下降（P＜0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組與加減三甲散組之間大鼠全血高切粘度(200S-1)、低切粘度

7、(5S-1)、紅細(xì)胞壓積、血沉水平比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　6.本次研究共篩選出108個(gè)差異表達(dá)蛋白。在模型組與正常組比較中，共有72個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中29個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，43個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)；在加減三甲散組與模型組比較中，共有43個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中19個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，24個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)；同時(shí)在模型組與正常組比較、加減三甲散組與模型組比較中均有差異的蛋白有7個(gè)。主要包括涉及機(jī)體代謝的酶蛋白，其次是機(jī)體免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白

8、，參與細(xì)胞發(fā)育調(diào)控的蛋白及一些生物調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白等。
　　7.模型組與空白組比較，Cofilin2和NADH dehydrogenase在模型組表達(dá)下調(diào)，ACSM3在模型組表達(dá)上調(diào)；加減三甲散組與模型組比較，Cofilin2和NADH dehydrogenase在加減三甲散組表達(dá)上調(diào)，ACSM3在加減三甲散組表達(dá)下調(diào)。Western blotting驗(yàn)證結(jié)果與蛋白組學(xué)研究結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.采用豬血清腹腔注射

9、法可成功復(fù)制大鼠免疫性肝纖維化模型。
　　2.加減三甲散可改善肝纖維化模型大鼠病理形態(tài)、部分血清肝纖維指標(biāo)及肝功能指標(biāo)及血液流變性指標(biāo)。
　　3.采用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)共鑒定并篩選出108個(gè)差異表達(dá)蛋白，這些差異表達(dá)蛋白可能通過(guò)交互作用共同體現(xiàn)“主客交”理論部分內(nèi)涵。
　　4.Cofilin2、ACSM3及NADH dehydrogenase可能是加減三甲散治療肝纖維化的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入研究