砂梨體內(nèi)與高溫脫除ASGV相關(guān)差異表達(dá)基因功能的初步研究.pdf

1、目的：蘋果莖溝病毒(Apple Stem Grooving Virus，ASGV)是β線性病毒科（betaflexiviridae），發(fā)狀病毒屬（capillovirus）的代表種，正單鏈 RNA病毒，基因組大小6.5kb，寄主范圍廣泛，可侵染梨、蘋果、杏、獼猴桃等多種核果類和仁果類果樹，影響著果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)，給產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，熱處理和組織培養(yǎng)相結(jié)合是獲得無毒苗木采用的主要方式，但其脫毒的分子機(jī)制，如高溫是否可以激活

2、寄主體內(nèi)某些基因的表達(dá)或一些與病毒互作相關(guān)的熱激蛋白及與抗病相關(guān)的熱激信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號分子增加等途徑不清楚，導(dǎo)致果樹脫毒效果不穩(wěn)定，嚴(yán)重制約了果樹病毒病害的有效防治。本研究一方面通過分析熱處理?xiàng)l件下砂梨體內(nèi)抗病相關(guān)基因和沉默途徑相關(guān)基因的表達(dá)量，初步分析熱處理脫毒的機(jī)理；另一方面，構(gòu)建砂梨“金水二號”品種 ASGV分離物（命名為 ASGV-Js2）的侵染性克隆，明確其侵染特性，旨在為深入探究砂梨抗病基因的功能提供材料。
　　方法：

3、1.本研究分別對24℃正常培養(yǎng)和37℃熱處理培養(yǎng)1d和5d的感染ASGV的砂梨“金水二號”莖尖組織混合樣進(jìn)行 RNA-seq測序，并結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選抗病相關(guān)差異表達(dá)相關(guān)基因，并采用 qRT-PCR的方法分析其表達(dá)量變化。2.采用 qRT-PCR方法分析不同溫度處理?xiàng)l件下砂梨體內(nèi)與基因沉默途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因（PpAGO1, PpAGO2, PpAGO4, PpDCL2, PpDCL4和PpRdRp1）在無毒和感染ASGV兩種植株

4、體內(nèi)的表達(dá)量變化，同時構(gòu)建PpAGO1,2,4，PpDCL2 VIGS沉默載體，進(jìn)一步探究基因沉默途徑相關(guān)基因的功能。3.通過重疊延伸 PCR及同源重組的方法獲得 ASGV-Js2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆，通過注射的方式接種昆諾黎和心葉煙，檢測其致病性，進(jìn)而判斷構(gòu)建重組質(zhì)粒的侵染性。
　　結(jié)果：1.從兩種溫度處理的轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選得到783個差異表達(dá)基因，其中531個為上調(diào)表達(dá)基因和252個為下調(diào)表達(dá)基因。GO功能分類顯示，篩選得到

5、的差異表達(dá)基因錄屬于生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別，其中，“代謝途徑”，“細(xì)胞過程”，“刺激應(yīng)答反應(yīng)”等生物學(xué)過程所占基因數(shù)目居多。KEGG Pathway顯著性富集分析表明，代謝通路及次級代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)基因顯著富集。采用 real-time PCR對隨機(jī)選擇的10個差異表達(dá)基因，包括具有防御、復(fù)制、翻譯等功能的5個上調(diào)表達(dá)基因，以及代謝、轉(zhuǎn)錄因子和未知功能蛋白等5個下調(diào)基因進(jìn)行熱處理?xiàng)l件下梨莖尖和基部部位表達(dá)量分析，結(jié)果

6、驗(yàn)證了 RNA-seq測序結(jié)果的可靠性，同時表明差異基因在莖尖和基部的表達(dá)存在組織特異性。熱處理?xiàng)l件下病毒 mp基因在莖尖和基部表達(dá)量均下調(diào)，表明高溫抑制病毒在植物體內(nèi)的復(fù)制。同時篩選抗病相關(guān)基因 Pp899，real-time PCR結(jié)果表明其在高溫條件下上調(diào)表達(dá)，初步推測其參與抗病途徑。
　　2.基因沉默途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因表達(dá)量分析：首次克隆并獲得了來源于砂梨沉默途徑相關(guān)基因：PpAGO1, PpAGO2, PpAGO4,

7、 PpDCL2, PpDCL4和PpRdRp1序列。熒光結(jié)果顯示PpAGO1， PpDCL2，PpRdRp1基因的表達(dá)在熱處理?xiàng)l件下表達(dá)量顯著上升，推測其參與參與基因沉默途徑；PpAGO2，PpDCL4基因的表達(dá)受高溫和病毒共同影響。PpAGO2 TRV VIGS沉默載體接種煙草后，煙草體內(nèi)TRV病毒含量下降，表明砂梨基因?qū)Σ《镜膹?fù)制和積累有影響，但其作用機(jī)制不明確。
　　3.成功構(gòu)建 ASGV-Js2分離物的侵染性克隆，并通過農(nóng)