腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表達(dá)S100A16維系其線粒體穩(wěn)定性的研究.pdf

1、目的:迄今為止肺癌仍是人類健康的重要威脅，肺癌分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。小細(xì)胞肺癌是分化程度較低的腫瘤，具有增殖速率快、發(fā)生轉(zhuǎn)移早的特點(diǎn)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的小細(xì)胞肺癌患者存活期極短。因此，研究小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)小細(xì)胞肺癌的診斷與治療具有重要意義。
　　小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移具有嗜腦性，由于血腦屏障(BBB)的特殊構(gòu)造，腫瘤的腦轉(zhuǎn)移有其獨(dú)特之處。腦轉(zhuǎn)移的腫瘤必須通過(guò)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)組成的緊密連接，

2、并且在腦轉(zhuǎn)移的早期腫瘤細(xì)胞需要依附于血管才能生存下來(lái)。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞亦能夠從多個(gè)方面影響轉(zhuǎn)移后的腫瘤細(xì)胞，使生存下來(lái)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生一系列變化，從而在腦內(nèi)形成轉(zhuǎn)移灶。
　　S100A16蛋白是S100蛋白家族的新成員，在正常組織中低表達(dá)，而在許多腫瘤組織中表達(dá)升高，提示其與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。S100A16在不同的細(xì)胞中發(fā)揮著不同的功能。文獻(xiàn)報(bào)道，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中S100A16可以通過(guò)感知細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)發(fā)生核轉(zhuǎn)位;前列腺癌中S1

3、00A16能夠通過(guò)AKT和ERK信號(hào)通路促進(jìn)前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移;乳腺癌中S100A16能夠上調(diào)Notch1，ZEB1，ZEB2，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)化;而在肺腺癌細(xì)胞膜上S100A16是一個(gè)獨(dú)立的腫瘤預(yù)后因子。血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞多過(guò)表達(dá)S100A16，提示其可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　腫瘤細(xì)胞的代謝有著自己的特點(diǎn)。Wrburg效應(yīng)指出腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)無(wú)氧酵解產(chǎn)生大量的能量，而該過(guò)程不需要線粒體的參與。所以腫瘤細(xì)胞的線

4、粒體必然有著與正常細(xì)胞不同的特點(diǎn)。同時(shí)線粒體在細(xì)胞凋亡的早期也發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)線粒體受到損傷時(shí)，線粒體內(nèi)膜非特異性通透性孔道(MPTP)開(kāi)放引起線粒體膜電位崩潰，細(xì)胞色素c外漏，從而啟動(dòng)caspase的級(jí)聯(lián)活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　本研究由S100A16蛋白入手，探究HBMEC培養(yǎng)上清在小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮的作用，對(duì)探明小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制具有一定的意義。
　　研究方法:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中S100A16

5、表達(dá)水平的檢測(cè)，確定NCI-H446細(xì)胞作為研究對(duì)象;通過(guò)用HBMEC細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激NCI-H446細(xì)胞模擬體內(nèi)小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移過(guò)程中與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用并檢測(cè)此條件下NCI-H446細(xì)胞中S100A16表達(dá)量的變化;在此基礎(chǔ)上構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)S100A16的NCI-H446細(xì)胞株，利用MTS、PI染色、劃痕實(shí)驗(yàn)、跨內(nèi)皮遷移實(shí)驗(yàn)、AnnexinⅤ-FITC染色、JC-1染色檢測(cè)細(xì)胞各項(xiàng)生理功能的變化。在HBMEC上清刺激N

6、CI-H446細(xì)胞的條件下驗(yàn)證高表達(dá)S100A16后NCI-H446細(xì)胞生理功能的變化，以此確定該功能的變化與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的聯(lián)系。通過(guò)H2O2刺激，檢測(cè)S100A16蛋白表達(dá)量的變化以及NCI-H446-S100A16細(xì)胞株抵抗H2O2造成的線粒體損傷的能力。并檢測(cè)HBMEC培養(yǎng)上清是否同樣具有抵抗H2O2造成的線粒體損傷的能力。最后通過(guò)檢測(cè)線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平初步探究S100A16蛋白維護(hù)小細(xì)胞肺癌線粒體膜電位穩(wěn)定的

7、機(jī)制。
　　結(jié)果:1、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446細(xì)胞株中S100A16表達(dá)水平較低，而NCI-H250細(xì)胞株和NCI-H209細(xì)胞株中幾乎沒(méi)有S100A16的表達(dá)，HBMEC細(xì)胞株中S100A16有一定的表達(dá)。2、HBMEC細(xì)胞的培養(yǎng)上清能夠刺激NCI-H446細(xì)胞中S100A16的表達(dá)。3、S100A16的高表達(dá)不影響NCI-H446細(xì)胞株的細(xì)胞周期，遷移能力和跨內(nèi)皮遷移能力，但能夠在一定程度上影響其增殖能力。4、S100A

8、16的高表達(dá)有助于維持NCI-H446細(xì)胞株線粒體膜電位，抵抗H2O2所造成的線粒體損傷并且HBMEC培養(yǎng)上清培養(yǎng)的NCI-H446細(xì)胞有著與NCI-H446-S100A16細(xì)胞株相同的特點(diǎn)。5、NCI-H446-S100A16細(xì)胞株線粒體凋亡相關(guān)蛋白SMAC表達(dá)量明顯降低，并且其線粒體組分中細(xì)胞色素C表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:1、HBMEC細(xì)胞的培養(yǎng)上清能夠促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中S100A16的表達(dá)，使小細(xì)胞肺癌細(xì)胞線粒