體外炎性條件下成肌細(xì)胞-分化肌管的免疫特性研究.pdf

1、骨骼肌是體內(nèi)最大的細(xì)胞庫(kù)，也是常見的免疫應(yīng)答場(chǎng)所（如肌肉自身免疫疾病、肌內(nèi)感染、肌肉途徑的疫苗和轉(zhuǎn)基因治療等）。生理?xiàng)l件下，肌衛(wèi)星細(xì)胞和成熟的肌纖維均缺乏MHC分子表達(dá)。但有研究證實(shí)，體外分離培養(yǎng)的人成肌細(xì)胞能表達(dá)MHC-Ⅰ（人類白細(xì)胞抗原Ⅰ，HLA classⅠ），促炎的細(xì)胞因子（如IFN-γ，TNF-α，IL-1α，IL-1β，或MIP-1α）會(huì)進(jìn)一步上調(diào)成肌細(xì)胞的HLA-Ⅰ表達(dá)。接受IFN-γ刺激后，成肌細(xì)胞和分化肌管均表達(dá)MHC

2、-Ⅱ分子(HLA class-Ⅱ)。因此有學(xué)者指出，骨骼肌細(xì)胞是一種兼職的(non-professional)抗原呈遞細(xì)胞(APC)。
　　體外條件下，成肌細(xì)胞表達(dá)免疫蛋白酶亞單位（如LMP2，LMP7，MECL1），能夠處理內(nèi)源性抗原（通過MHC-Ⅰ通路）并被CD8+T細(xì)胞識(shí)別。炎性培養(yǎng)環(huán)境中的成肌細(xì)胞亦表達(dá)與MHC-Ⅱ抗原處理和呈遞相關(guān)的關(guān)鍵酶（如Cathepsins），參與呈遞外源或內(nèi)源抗原至CD4+T細(xì)胞。接受炎性刺激的人

3、成肌細(xì)胞持續(xù)表達(dá)黏附分子（如LFA-1，ICAM-1）和共刺激分子（如ICOS-L，PD-L1，CD40）。上述研究均支持骨骼肌細(xì)胞在炎性環(huán)境中具備APC功能并參與驅(qū)動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)。
　　有關(guān)骨骼肌細(xì)胞免疫特性的研究均選用人的成肌細(xì)胞及分化肌管。罕有文獻(xiàn)報(bào)道目前廣泛應(yīng)用的成肌細(xì)胞株（如C2C12，L6細(xì)胞）是否表達(dá)MHC分子并具備APC功能。炎性肌病及肌無力患者的骨骼肌細(xì)胞本身是自身免疫反應(yīng)的攻擊目標(biāo)。在肌組織內(nèi)的免疫應(yīng)答過程中

4、，肌細(xì)胞與炎癥反應(yīng)的相互左右如何，尚待闡明。
　　本研究中，我們嘗試將體外增殖或分化培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞置于IFN-γ誘導(dǎo)的炎性環(huán)境中，分析成肌細(xì)胞及分化肌管的免疫學(xué)特性。結(jié)果表明，較之增殖的成肌細(xì)胞，分化肌管對(duì)炎性刺激更為敏感。INF-γ刺激條件下，分化肌管顯著上調(diào)MHC-Ⅰ/MHC-Ⅱ及TLR3/TLR7分子表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，INF-γ同時(shí)誘導(dǎo)分化肌管上調(diào)一些共刺激/共抑制分子（包括CD40、CD86、ICAM-1、IC

5、OS-L及PD-L1）。對(duì)ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)的檢測(cè)表明， IFN-γ誘導(dǎo)的肌管內(nèi)NLRP3炎癥小體被活化。相關(guān)的促炎細(xì)胞因子及趨化因子的mRNA水平在INF-γ處理的成肌細(xì)胞和分化肌管中均顯著上調(diào)，包括IL-1、IL-6及MCP-1。采用共培養(yǎng)及T細(xì)胞活化實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步證實(shí)體外炎性培養(yǎng)的分化肌管能促進(jìn)CD4+、CD8+T的體外增殖。因此，本研究結(jié)果表明，肌細(xì)胞（尤其是分化肌纖維）在體外炎性環(huán)境中

6、能夠被誘導(dǎo)表達(dá)免疫表型。我們的結(jié)果提示，肌細(xì)胞能主動(dòng)參與骨骼肌的炎癥/免疫反應(yīng)。
　　主要研究?jī)?nèi)容:
　　第一章 C2C12細(xì)胞的體外培養(yǎng)及分化誘導(dǎo)
　　目的：
　　采用C2C12細(xì)胞，獲取激活并增殖的成肌細(xì)胞和分化肌管。
　　方法：
　　常規(guī)復(fù)蘇后C2C12細(xì)胞，用含100mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素及體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基接種，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中增殖培

7、養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C2C12細(xì)胞傳代培養(yǎng)，鏡下觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80％時(shí)，換用含100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)為2％馬血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　結(jié)果：
　　C2C12細(xì)胞在含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞呈梭狀，生長(zhǎng)較快。換馬血清培養(yǎng)3～4天后，鏡下可見細(xì)胞融合，肌管形成，隨時(shí)間推移，細(xì)胞密度變大，體積增加，多核肌管的數(shù)量逐漸增加

8、。
　　結(jié)論：
　　體外常規(guī)培養(yǎng)條件下，C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖良好。馬血清誘導(dǎo)能促使增殖的成肌細(xì)胞分化并融合為肌管，可用于下一步的實(shí)驗(yàn)研究。第二章體外炎性環(huán)境誘導(dǎo)成肌細(xì)胞/分化肌管表達(dá)MHC及TLRs
　　目的：
　　分析在IFN-γ構(gòu)建的體外炎性環(huán)境中，成肌細(xì)胞/分化肌管能否表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體(MHC-Ⅰ/Ⅱ)及Toll樣受體3/7(TLR3/7)，從而明確肌細(xì)胞表達(dá)免疫分子的潛能。
　　方法：<

9、br>　　將C2C12成肌細(xì)胞，或馬血清分化的肌管分別培養(yǎng)于添加IFN-γ(0.6ug/ml)的DMEM培養(yǎng)基中。分別于培養(yǎng)后24h及48h，采用免疫熒光、Western blot、q-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、TLR3/7表達(dá)水平，并對(duì)比分析。
　　結(jié)果：
　　蛋白印記的檢測(cè)表明，MHC-Ⅰ分子H-2Kb、Toll樣受體3和7(TLR3/TLR7)的蛋白水平在增殖和分化的C2C12細(xì)胞均呈現(xiàn)低表達(dá)，但

10、IFN-γ刺激導(dǎo)致上述分子表達(dá)顯著上調(diào)。分化肌管中，H-2Kb、TLR3、TLR7的表達(dá)水平顯著高于增殖的成肌細(xì)胞，并于分化48h時(shí)達(dá)表達(dá)高峰。IFN-γ刺激前后，成肌細(xì)胞均不表達(dá)MHC-Ⅱ分子H2-Ea。但H2-Ea在分化肌管中呈陽(yáng)性表達(dá)，IFN-γ刺激進(jìn)一步上調(diào)其表達(dá)水平。q-PCR、流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光染色的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在IFN-γ刺激后，分化肌管上調(diào)TLR3/7及MHC-Ⅰ/Ⅱ的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　體外炎性環(huán)境

11、下，肌細(xì)胞能表達(dá)TLR3/7及MHC-Ⅰ/Ⅱ分子，且分化融合肌管的表達(dá)水平顯著高于增殖的成肌細(xì)胞，提示肌纖維對(duì)炎性刺激的反應(yīng)更為敏感。
　　第三章 體外炎性環(huán)境誘導(dǎo)成肌細(xì)胞/分化肌管表達(dá)其他免疫分子
　　目的：
　　檢測(cè)IFN-γ能否誘導(dǎo)成肌細(xì)胞/分化肌管表達(dá)其他炎性分子，如NLRP3炎癥小體、相關(guān)細(xì)胞因子、共刺激/共抑制分子、粘附分子等。
　　方法：
　　將成肌細(xì)胞/分化肌管分別于添加IFN-γ的饑餓培養(yǎng)

12、基/分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，q-PCR檢測(cè) IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-18、TGF-β、MCP-1、MIP-1a、TNF-α的基因表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD40、CD80、CD86、ICOS-L，PD-L1的表達(dá)水平，免疫熒光及Western blot檢測(cè)細(xì)胞炎癥小體組分NLRP3、ASC及mature-caspase-1的表達(dá)改變。ELISA檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞釋放IL-1β的程度。
　　結(jié)果：<

13、br>　　免疫熒光、qPCR和Western blot檢測(cè)證實(shí)，IFN-γ誘導(dǎo)成肌細(xì)胞/分化肌管上調(diào)NLRP3、ASC和mature-caspase-1表達(dá)水平。q-PCR分析顯示，未接受IFN-γ炎性刺激的成肌細(xì)胞和肌管表達(dá)促炎的IL-1、IL-6、IL-18及MCP-1，但不表達(dá)IL-8及IL-15。IFN-γ則誘導(dǎo)分化肌管顯著上調(diào)IL-1，IL-6和MCP-1的mRNA水平。 IFN-γ誘導(dǎo)成肌細(xì)胞和分化肌管上調(diào)抗炎的IL-10

14、mRNA水平，以分化肌管的表達(dá)上調(diào)更為顯著。ELISA結(jié)果顯示，肌細(xì)胞，尤其是分化肌管呈現(xiàn)IFN-γ誘導(dǎo)性IL-1β釋放增加。FACS檢測(cè)證實(shí)，C2C12成肌細(xì)胞和肌管均表達(dá)CD80，但I(xiàn)FN-γ刺激不改變CD80陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。反之，IFN-γ誘導(dǎo)CD86陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加。未接受刺激的C2C12細(xì)胞呈CD40，ICOS-L及ICAM-1的低表達(dá)，IFN-γ刺激后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加。此外，IFN-γ誘導(dǎo)PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多。

15、r>　　結(jié)論：
　　體外炎性環(huán)境能誘導(dǎo)成肌細(xì)胞/分化肌管表達(dá)、或上調(diào)NLRP3炎癥小體、特定的細(xì)胞因子、共刺激/共抑制分子以及粘附分子，使肌細(xì)胞，尤其是分化的肌纖維呈現(xiàn)免疫細(xì)胞的表型特征。
　　第四章 炎性誘導(dǎo)的分化肌管促進(jìn)T細(xì)胞的活化與增殖
　　目的：
　　評(píng)估炎性誘導(dǎo)的肌細(xì)胞是否影響T細(xì)胞的增殖改變，從而驗(yàn)證其作為抗原呈遞細(xì)胞的潛能。
　　方法：
　　自野生B6小鼠脾臟中分離純化CD4+和CD8+