糖尿病相關干眼以及Sj_gren綜合征淚液蛋白質(zhì)組的表達譜分析.pdf

1、目的：干眼是發(fā)病率極高的眼表疾病，嚴重者可失明。其中，龐大的糖尿病人群是干眼發(fā)病的重要因素：而干燥綜合征導致的干眼最為嚴重。在本研究中，我們嘗試建立正常人、糖尿病患者與干燥綜合征患者淚液蛋白質(zhì)組表達譜；發(fā)現(xiàn)后兩者與正常眼淚液蛋白質(zhì)組間的差異蛋白質(zhì)，并嘗試找出候選的相關干眼分子標志物；并對上述試驗組的蛋白質(zhì)組定量檢測結(jié)果和臨床資料進行多元相關分析；本研究的相關結(jié)果將助于從分子水平闡明于眼病的發(fā)病機制，并將對干眼進一步的深入研究提供一些思路

2、。
　　 方法：(1)應用干眼的調(diào)查問卷篩選、搜集和記錄入選志愿者，分為五組：A組：正常對照組，B組：糖尿病不伴發(fā)干眼組,C組：糖尿病伴發(fā)干眼組，D組：非干燥綜合征干眼組，E：干燥綜合征組。(2)二維液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜(2D-Nano-LC-ESI-MS/MS)分別對五組入選的淚液標本分離和鑒定。(3)應用生物信息學的研究方法對所獲的淚液蛋白質(zhì)組學表達譜進行分析。(4)采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計包進行統(tǒng)計學分析（p＜0.05有統(tǒng)

3、計學意義）。
　　 結(jié)果：
　　 1、A組、B組和C組的結(jié)果A組、B組和C組患者的年齡和性別無統(tǒng)計學差異(p=0.601)，C組患者的糖尿病病史較B組長且空腹血糖水平在三組中最高，最佳矯正視力最低(p=0.000)；與A組比較，B組和C組患者的SIT和BUT(p=0.000，0.000)降低，熒光素鈉染色得分增高(p=0.000)，且C組改變最明顯。
　　 A組、B組和C組患者的SchirmerI試紙淚液蛋白質(zhì)密

4、度分別為0.2028±0.1415μg/mm，0.2668±0.1302μg/mm和1.1905±0.7568μg/mm;組間具有明顯的統(tǒng)計學差異(p=0.0003)。其鑒定的蛋白質(zhì)種類分別為210種、180種和219種。A組、B組和C組的淚液中極酸性蛋白質(zhì)種類分別為29種(13.81％)、18種(9.95%)和27種(12.44%)，極堿性蛋白質(zhì)分別為19種(9.05%)，19種(10.5%)和17種(8.1%)。
　　 對鑒

5、定蛋白質(zhì)進行亞細胞定位、參與生物過程以及分子功能分析，發(fā)現(xiàn)C組定位于細胞內(nèi)、細胞外、蛋白復合體、細胞器等位置的蛋白種類增加，其中凋亡相關蛋白20種、炎癥和免疫相關蛋白12種、單糖和多糖代謝過程的蛋白6種，其蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合能力、脂質(zhì)結(jié)合能力和離子結(jié)合能力均較A組明顯上調(diào)。
　　 我們還發(fā)現(xiàn)索引號為IPI00450309的蛋白IGL@蛋白在A組淚液中未檢測到，而在B組和C組淚液中含量呈遞增改變。
　　 2、A組、D組和E

6、組的結(jié)果A組、D組和E組患者的年齡和性別無統(tǒng)計學差異(p=0.185)，E組患者唇腺活檢的淋巴細胞計數(shù)均超過50個；與A組比較，D組和E組患者的SIT和BUT降低(p=0.000，0.000)，熒光素鈉染色得分增高(p=0.000)，且E組改變最明顯。
　　 A組、D組和E組患者的SchirmerⅠ試紙淚液蛋白質(zhì)密度分別為0.2028±0.1415μg/mm．1.0839±0.8959μg/mm和1.8291±1.7928μg/

7、mm;組間具有明顯的統(tǒng)計學差異(p=0.035)，而D組和E組間汨液蛋白質(zhì)密度無統(tǒng)計學差異(p=0.213)。其鑒定的蛋白質(zhì)種類分別為210種、263種和295種；E組極堿性蛋白質(zhì)29種，較A組19種明顯增加。
　　 對鑒定蛋白質(zhì)進行亞細胞定位、參與生物過程以及分子功能分析，發(fā)現(xiàn)E組定位于細胞內(nèi)、細胞外、蛋白復合體、細胞器等位置的蛋白種類增加，其中凋亡相關蛋白26種、炎癥和免疫相關蛋白12種、參與眼表防御反應的蛋白8種，其蛋白質(zhì)

8、-蛋白質(zhì)結(jié)合能力、酶抑制因子和氧化酶活性均較A組明顯上調(diào)，而超氧化物酶活性下調(diào)。
　　 我們還發(fā)現(xiàn)索引號為IPI00878888的CDNAFLJ78387蛋白質(zhì)和索引號IP100020091的α-1-ACID糖蛋白2在A組淚液中未檢測到，而在E組淚液中含量呈大大增加。
　　 結(jié)論：
　　 A組、B組、C組、D組和E組嚴格按照入選標準和標本采集程序進行，為淚液蛋白質(zhì)組學實驗的進行提供了保證。
　　 蛋白質(zhì)組

9、學是一門新興科學，可以從整體、動態(tài)、網(wǎng)絡的水平上對蛋白質(zhì)進行研究。本次實驗采用的nano-ESI-MS/MS實驗技術的檢測極為精密，可以達到fmol數(shù)量級，這對于鑒定豐度低，但發(fā)揮重要作用的蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)錄因子、信號傳導蛋白等很有效。LC與nano-ESI質(zhì)譜的在線聯(lián)接推動了納升級流速毛細管分離柱的應用。納升級流速色譜不僅節(jié)省樣品（干眼患者能夠采集的淚液量極少）與流動相（減少環(huán)境污染），而且還能提高色譜峰的相對強度和檢測靈敏度，對鑒定低豐

10、度蛋白質(zhì)提高表達譜覆蓋率有促進作用。本次實驗操作過程順利，獲得了質(zhì)量很高的圖譜，從而成功的獲得了各組患者淚液蛋白質(zhì)組的表達譜信息。
　　 糖尿病是干眼病的一個重要影響因素。對于干眼患者，隨糖尿病病程的延長、病情的加重，其淚膜穩(wěn)定性和淚液分泌量明顯下降，眼表細胞損傷加重；淚液蛋白質(zhì)的密度、種類較正常對照組明顯增加，并出現(xiàn)細胞凋亡增強、炎癥和免疫反應明顯、糖代謝紊亂、細胞骨架重塑等過程，為干眼的發(fā)生提供了病理依據(jù)。IGL@蛋白在糖尿

11、病相關干眼組中大大增加，我們推測該蛋白可能是糖尿病相關干眼的標志性分子，尚需進一步實驗驗證。
　　 干燥綜合征和非干燥綜合征性干眼淚液蛋白質(zhì)的密度、種類較正常對照組明顯增加.而干燥綜合征組極堿性蛋白質(zhì)種類增加；干眼患者出現(xiàn)細胞凋亡增強、免疫反應增強、眼表防御屏障破壞、細胞骨架重塑等過程，其中干燥綜合征組眼表免疫反應尤其明顯.這可能與疾病本身相關。CDNAFLJ78387蛋白質(zhì)和α-1-ACID糖蛋白2在干燥綜合征組淚液中大量增加