酪蛋白飲食防止ECM發(fā)生的相關(guān)免疫機(jī)制研究.pdf

1、目前世界上有2.7億人患瘧疾，主要發(fā)生在撒哈拉以南非洲地區(qū)，每年新發(fā)病例200萬(wàn)人，引起超過(guò)100萬(wàn)人死亡，絕大多數(shù)是兒童。在瘧疾感染引起的各種臨床癥狀中，腦瘧（Cerebral Malaria，CM）引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥是最主要的死亡原因之一。營(yíng)養(yǎng)不良影響著發(fā)展中國(guó)家近20％的人口，在撒哈拉以南非洲地區(qū)，有將近三分之一的五歲以下兒童因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)不良而體重過(guò)輕和發(fā)育遲緩，低蛋白飲食是造成兒童營(yíng)養(yǎng)不良的一個(gè)主要和常見(jiàn)原因。瘧疾感染會(huì)降低五歲以

2、下兒童的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，加重兒童營(yíng)養(yǎng)不良的結(jié)局，營(yíng)養(yǎng)不良也進(jìn)一步增加瘧疾的易感性、發(fā)病率和死亡率。
　　 CM是由惡性瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞在腦組織微血管的沉積所引起的一系列并發(fā)癥。iRBCs和過(guò)強(qiáng)的炎癥應(yīng)答是CM發(fā)生所必需的兩個(gè)條件。一般認(rèn)為是iRBCs結(jié)合到微血管內(nèi)皮上，引起全身性炎癥反應(yīng)，但主要局限于iRBC沉積的部位，包括細(xì)胞因子、趨化因子、白細(xì)胞（T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）以及iRBCs參與微血管的病理?yè)p傷，促進(jìn)ECM的發(fā)生，免疫病理

3、損傷的發(fā)生需要微血管循環(huán)或沉積的iRBCs持續(xù)刺激。CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ促進(jìn)CD8+T細(xì)胞在腦組織的聚集。CD8+T細(xì)胞通過(guò)一種穿孔素依賴機(jī)制來(lái)介導(dǎo)CM的發(fā)生。盡管中性粒細(xì)胞不沉積在腦組織中，但其通過(guò)通過(guò)增加腦組織中前炎癥細(xì)胞因子尤其是IL-12的表達(dá)水平參與ECM的發(fā)生。IFN-γ能夠激活一些通路，尤其是IP10/CXCL10。TNF-α能夠抵抗瘧疾感染，殺傷瘧原蟲(chóng)，但血清中高濃度的TNF-α與重癥瘧疾如CM發(fā)生密切相關(guān)。T

4、NF-α能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的活化，從而上調(diào)一些粘附分子如ICAM-1、CD36和VCAM-1的表達(dá)。其中ICAM-1參與iRBCs的粘附，iRBCs粘附在血管壁上會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引起血管通透性的改變及血腦屏障的破壞。TGF-β能夠通過(guò)增強(qiáng)IL-10的產(chǎn)生水平抑制TNF-α、NO以及IFN-γ的產(chǎn)生，最終可引起機(jī)體免疫應(yīng)答從Th1型轉(zhuǎn)向Th2型。趨化因子能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理?yè)p傷。CXCR3的兩個(gè)配體CXCL9和CXCL10 mRNA

5、水平高度升高，參與ECM的發(fā)生。細(xì)胞粘附分子會(huì)促進(jìn)趨化至血管部位的炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮的結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞在腦部微血管的沉積。瘧色素可以活化MMP9基因參與CM的發(fā)生。
　　 脾臟中的免疫細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在控制瘧疾感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。DCs作為重要的抗原提呈細(xì)胞，能夠捕獲抗原，并在向淋巴組織T細(xì)胞區(qū)移行的過(guò)程中逐漸成熟，活化抗原特異性的T細(xì)胞。活化的CD4+T細(xì)胞通過(guò)

6、分泌細(xì)胞因子如IFN-γ來(lái)促進(jìn)對(duì)瘧原蟲(chóng)的殺傷作用。Th1免疫應(yīng)答在感染早期控制瘧疾感染方面具有重要作用，但同時(shí)也能引起CM的發(fā)生。作為平衡體內(nèi)免疫應(yīng)答一群重要細(xì)胞，Treg能夠通過(guò)分泌細(xì)胞因子如TGF-β和IL-10以及增加調(diào)節(jié)分子CTLA-4的表達(dá)抑制體內(nèi)異?；蜻^(guò)強(qiáng)的T細(xì)胞應(yīng)答，從而防止自身免疫性反應(yīng)。瘧疾感染時(shí)，巨噬細(xì)胞可以直接吞噬感染的紅細(xì)胞，NO和活性氧簇有助于吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞在胞吞病原體之后對(duì)病原體的殺傷。
　　 酪

7、蛋白是牛奶蛋白質(zhì)的主要組成部分，約占總蛋白的80％。作為新生兒生長(zhǎng)所需要的氨基酸主要來(lái)源之一，酪蛋白飲食在體內(nèi)會(huì)水解為很多功能肽，主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗菌作用。牛奶飲食尤其是其中的酪蛋白對(duì)P.berghei感染結(jié)局具有預(yù)防作用，酪蛋白經(jīng)水解之后的多肽能夠調(diào)節(jié)免疫功能，來(lái)自αs1-、β-和κ-酪蛋白的肽片段能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖。然而，也有體外研究表明β-casomorphin-7和β-casokinin-10在高濃度時(shí)增強(qiáng)免疫功能，低濃度時(shí)抑

8、制免疫功能。阿片樣β-酪啡肽等免疫刺激劑能夠激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性，并在T細(xì)胞的增殖和成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，αs1-酪蛋白和β-酪蛋白的某些肽片段能抑制絲裂原誘導(dǎo)的人淋巴細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖，但在缺少絲裂原時(shí)又能刺激淋巴細(xì)胞增殖。酪蛋白水解物通過(guò)增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的IL-2以及IFN-γ產(chǎn)生來(lái)增強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答，但對(duì)IL-4和IL-10產(chǎn)生沒(méi)有影響。為此，本研究通過(guò)給C57BL/6小鼠喂食不同含量的酪蛋白飲食后，感染伯氏瘧

9、原蟲(chóng)(Plasmodiumberghei ANKA，PbA)建立ECM模型，明確酪蛋白飲食對(duì)瘧疾感染過(guò)程和結(jié)局的影響。揭示酪蛋白防止ECM發(fā)生的相關(guān)機(jī)制，并為流行區(qū)腦瘧兒童免疫干預(yù)策略的確立提供新的理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型構(gòu)建
　　 3-4周齡，雌性C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔感染感染1×106 Pb ANKA寄生紅細(xì)胞，感染前給予不同酪蛋白飲食飼養(yǎng)一個(gè)月。監(jiān)測(cè)小鼠體重和感染率。

10、　　 2、小鼠血腦屏障通透性檢測(cè)
　　 1)將各組小鼠靜脈注射200μl2％伊文思藍(lán)染料。
　　 2)1h后，心臟灌注生理鹽水而至流出清亮液體為準(zhǔn)，然后取腦，拍照。
　　 3)將各組小鼠的腦放入離心管中，管內(nèi)加入1ml甲酰胺，37℃孵育48h。
　　 4)將各管取出，3000rpm離心15min，取上清液200μl，放于96孔板中。
　　 5)630nm檢測(cè)OD值。
　　 3、免疫組化<

11、br>　　 腦組織切片標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過(guò)氧化物酶連結(jié)法（即S-p法）進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色:①切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化;②0.01mol/L檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)3min;③內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷溶液37℃下孵育15min;④非免疫性動(dòng)物血清37℃下孵育15min;⑤一抗4℃下孵育過(guò)夜，VCAM-1抗體稀釋比例均為1∶150;⑥生物素標(biāo)記的二抗37℃下孵育30min;⑦

12、鏈霉素親和素過(guò)氧化物酶溶液37℃下孵育30min;⑧新配置的DAB顯色液顯色5min;⑨蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。各步之間用PBS(PH=7.4)沖洗三次，每次5min。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。
　　 4、 Real-time RT-PCR
　　 腦組織Total RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄:按照說(shuō)明書(shū)Trizol提取腦組織RNA，然后使用分光光度計(jì)測(cè)定濃度。用PrimeScriptTM RT試劑盒（Takara公司）去除

13、基因組DNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為10μl，含有PrimeScriptTM緩沖液，PrimeScriptTM RT酶混合物，oligo dT引物(50μM)和隨機(jī)引物兩種(100μM)及500ng總RNA。Real-time反應(yīng):用得到的cDNA作為模板和特定引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用SYBR(R) Premix Ex TaqTM試劑盒在ABI7500(ABI，USA)機(jī)器上進(jìn)行定量PCR(Takara公司)。反應(yīng)條件如

14、下:95℃預(yù)變性30秒，40個(gè)PCR循環(huán)（95℃5秒和60℃30秒）。采用2-△△CT法量化各蛋白飲食組之間的相對(duì)基因表達(dá)。
　　 5、流式細(xì)胞術(shù)
　　 脾臟流式細(xì)胞術(shù):
　　 無(wú)菌取出感染前（第0d）和感染后第3d、5d小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17 mol/LNH4Cl裂解紅細(xì)胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml。每份樣品用抗-CD11 c-FIT

15、C單克隆抗體、抗-CD11b-PE單克隆抗體、抗-CD45R/B220-PerCP和抗-MHCⅡ-APC單克隆抗體進(jìn)行四色分析，另設(shè)陰性對(duì)照管。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專(zhuān)用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，每份樣品用抗-CD11 c-FITC單克隆抗體和/或抗TLR4-PE單克隆抗體進(jìn)行雙色分析，另設(shè)陰性對(duì)照管，離心去上清后，每管加入固定透膜劑250μl，1h后，洗滌細(xì)胞，加入生物素-TLR-9抗體，4℃染色30 mi

16、n，然后洗滌細(xì)胞，再加入親和素-PE，4℃染色30 min，洗滌細(xì)胞之后每管加入0.3ml細(xì)胞染色緩沖液。在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專(zhuān)用染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，刺激5h后，再加入抗-CD4-FITC單克隆抗體，固定透膜后加入抗T-bet-PerCP和IFN-γ-PE單克隆抗體，染色30min。離心去上清后，用0.3ml細(xì)胞染色緩沖液重懸浮細(xì)胞。每管加入脾細(xì)胞懸液0.1m，然后除對(duì)照管外，每管加入CM-H2DCF

17、DA（終濃度為5μM），37℃孵育30min，取出之后，用PBS洗滌，然后加入抗-F4/80-PerCP單克隆抗體和抗-CD11b-PE抗體進(jìn)行染色，之后洗滌細(xì)胞加入0.3ml細(xì)胞染色緩沖液。每份樣品用抗CD4-FITC和抗CD25-PE單抗進(jìn)行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC單抗進(jìn)行胞內(nèi)染色，用含1％ FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于0.5 ml PBS中，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
　　 腦組織流式細(xì)胞術(shù):
　　

18、 將小鼠處死，取出腦，用150目篩網(wǎng)研磨腦。然后加入到5ml含有100U/mlⅣ型膠原酶的RPMI1640中，42℃水浴45min。300g離心10min，收集細(xì)胞沉淀，用30％ Percoll重懸沉淀，然后加入到70％ Percoll上層（用PBS配制），515×g室溫離心30 min。收集中間層，加入10 ml PBS300×g離心10 min，然后標(biāo)記相應(yīng)的抗體:FITC-CD4、PE-CD11b、PerCP-CD8和APC-Gr

19、-1。4℃染色30 min，PBS洗滌細(xì)胞兩次，上機(jī)檢測(cè)，F(xiàn)lowjo軟件分析。
　　 6、ELISA
　　 用ELISA試劑盒分別檢測(cè)血清或脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-10的分泌水平。酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處OD值。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1Ls軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　

20、　 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和one wayANOVA比較分析組內(nèi)和組間均值差異。采用Kaplan-Meyer方法進(jìn)行生存期分析。P＜0.05為顯著差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、不同含量酪蛋白飲食對(duì)ECM小鼠的感染率和生存期的影響
　　 感染Pb ANKA的NC組小鼠于d3，在外周血中可見(jiàn)瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞(infectedred blood cells，iRBC

21、s)，隨后紅細(xì)胞感染率緩慢上升并維持在較低水平(＜10％)，于d5-9全部死于CM。5％酪蛋白飲食組小鼠在d9之前的原蟲(chóng)血癥水平變化與NC組小鼠相似，但小鼠全部存活，之后，原蟲(chóng)血癥水平逐漸升高，在感染后d23達(dá)到峰值(～50％)，d24～25死于貧血。20％和35％酪蛋白飲食組在感染后d7才可鏡檢到iRBCs，兩組紅細(xì)胞感染率顯著低于Pb ANKA感染小鼠(NC組)，隨后紅細(xì)胞感染率一直處于較低水平(＜2％)，于感染后d14紅細(xì)胞感染率

22、降至為0，小鼠自愈。
　　 2、不同含量蛋白飲食對(duì)體重及ECM臨床評(píng)分影響
　　 感染前1個(gè)月給予蛋白飲食會(huì)增加小鼠體重。各組小鼠體重在感染Pb ANKA后d1-d3體重下降，隨后NC組、20％和35％酪蛋白飲食組小鼠體重回升，而5％酪蛋白飲食組小鼠體重持續(xù)下降（與其它各組相比，P＜0.05）。感染Pb ANKA會(huì)引起給予維持飼料的C57BL/6小鼠(NC組)在d5-9天發(fā)生CM而死亡，與之相比，給予三種濃度的酪蛋白飲食

23、會(huì)明顯降低CM發(fā)生期間的臨床評(píng)分（與NC組相比，P＜0.05），同時(shí)低蛋白飲食(5％酪蛋白組)組小鼠的皮毛微微豎起，提示低蛋白飲食會(huì)影響小鼠的生理功能。
　　 3、不同含量酪蛋白飲食改善ECM血腦屏障的通透性
　　 腦瘧發(fā)生時(shí)腦組織血管的通透性明顯升高（與正常鼠相比，P＜0.01）。與NC組相比，給予不同含量酪蛋白飲食后能明顯抑制ECM引起的通透性升高(P＜0.01)。
　　 4、不同含量酪蛋白飲食對(duì)ECM血清前

24、炎癥細(xì)胞因子的影響
　　 感染后d3和d5，與ECM發(fā)生密切相關(guān)的IFN-γ水平在給予不同含量的酪蛋白飲食后均顯著低于NC組(P＜0.05);同時(shí)，各酪蛋白飲食組TNF-α水平在感染后d5也呈現(xiàn)相似的下降趨勢(shì)(P＜0.05)。
　　 5、不同含量酪蛋白飲食對(duì)腦組織CD4+、CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的影響
　　 在感染后d5，給予酪蛋白飲食能明顯降低腦組織中CD4+、CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量，提示不同含量

25、酪蛋白飲食能降低腦組織中與腦瘧過(guò)度前炎癥免疫應(yīng)答密切相關(guān)CD4+、CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量來(lái)預(yù)防ECM的發(fā)生。
　　 6、不同含量酪蛋白飲食對(duì)腦組織ECM發(fā)生相關(guān)因子表達(dá)水平的影響
　　 我們通過(guò)Real-time RT-PCR方法檢測(cè)了腦組織中與ECM發(fā)生密切相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示不同含量酪蛋白飲食均能抑制Pb ANKA感染后d5的前炎癥因子IFN-γ、TNF-α和MMP9 mRNA水平，粘附分子

26、ICAM-1和趨化因子CXCL9、CXCL10的基因表達(dá)水平也得到顯著抑制（與正常感染相比，P＜0.05），而酪蛋白飲食組小鼠腦組織的抑炎性細(xì)胞因子IL-10水平在感染后d3顯著高于NC組(P＜0.05)，TGF-β mRNA水平并未受到明顯影響。由此提示給予不同含量酪蛋白飲食能夠抑制ECM模型腦組織中的前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和粘附分子的表達(dá)水平。
　　 7、不同含量酪蛋白飲食對(duì)ECM腦部微血管粘附分子VCAM-1的影響

27、>　　 給予酪蛋白飲食能明顯降低腦組織微血管VCAM-1的表達(dá)水平，降低VCAM-1表達(dá)陽(yáng)性血管的數(shù)量及mRNA表達(dá)水平，提示不同含量酪蛋白飲食能通過(guò)降低腦組織VCAM-1的表達(dá)水平來(lái)預(yù)防ECM的發(fā)生。
　　 8、酪蛋白飲食對(duì)ECM模型中Th1細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的影響
　　 在感染后d3，給予20％和35％酪蛋白飲食能明顯增強(qiáng)Th1細(xì)胞數(shù)量及IFN-γ的分泌水平（與NC組相比，P＜0.05）;在感染后d5，Th1細(xì)胞

28、數(shù)量及TNF-α的分泌水平顯著降低(與NC組相比，P＜0.05)。
　　 9、不同含量酪蛋白飲食對(duì)ECM模型DC亞群及其功能分子的影響
　　 在感染后d3，給予不同含量酪蛋白飲食不影響CD11c+DCs、mDCs和pDCs數(shù)量（與NC組相比，P＞0.05），同時(shí)TLR4和MHCⅡ分子表達(dá)水平也沒(méi)有受到明顯影響，但給予20％酪蛋白顯著增強(qiáng)CD11c+ TLR9+ DCs細(xì)胞數(shù)量。在感染后d5酪蛋白飲食組mDCs的數(shù)量顯著低

29、于NC組(P＜0.05)，pDC和表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子的CD11c+DCs數(shù)量沒(méi)有明顯改變（與NC組相比，P＞0.05），但表達(dá)TLR4和TLR9的CD11c+DCs數(shù)量明顯降低（與NC組相比，P＜0.05）。
　　 10、酪蛋白飲食對(duì)ECM模型中巨噬細(xì)胞的影響
　　 在感染后d3，酪蛋白飲食組的CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量高于NC組(P＜0.05)，同時(shí)，酪蛋白飲食組中脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NO分泌水平也顯著高于NC

30、組(P＜0.05)，但同時(shí)CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞的ROS水平卻低于NC組。在感染后d5，酪蛋白飲食組與NC組之間的CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著差別，但20％酪蛋白飲食組的ROS水平高于NC組(P＜0.05)。
　　 11、酪蛋白飲食對(duì)ECM模型中Treg及IL-10的影響
　　 在感染后d3，酪蛋白飲食不影響Treg數(shù)量，20％和35％酪蛋白飲食組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-10水平顯著高于NC組(

31、P＜0.05)。在感染后d5，酪蛋白飲食會(huì)降低脾臟中Treg的數(shù)量及IL-10的mRNA水平，但培養(yǎng)上清中IL-10水平?jīng)]有明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.不同含量(5～35％)的酪蛋白飲食有助于維持血腦屏障的完整，預(yù)防ECM的發(fā)生。
　　 2.5％酪蛋白（低濃度酪蛋白）飲食雖能預(yù)防ECM發(fā)生，但會(huì)降低小鼠體重，影響小鼠生理功能，使其無(wú)法抵抗瘧原蟲(chóng)感染引起的重癥貧血。
　　 3.不同含量的酪蛋白飲食會(huì)

32、顯著降低ECM小鼠血清和腦組織中IFN-γ和TNF-α等前炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平，抑制腦組織過(guò)度的炎癥應(yīng)答，從而預(yù)防ECM的發(fā)生。
　　 4.不同含量的酪蛋白飲食能明顯降低ECM小鼠腦組織中的CD4+、CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步減少前炎癥細(xì)胞因子的分泌，減輕血管炎癥反應(yīng)，預(yù)防ECM的發(fā)生。
　　 5.不同含量的酪蛋白飲食能顯著降低腦組織與ECM發(fā)生密切相關(guān)的粘附分子和趨化因子的表達(dá)水平，防止血腦屏障的破壞，從