系統(tǒng)性硬皮病患者成纖維細(xì)胞高膠原合成克隆膠原基因轉(zhuǎn)錄特性與調(diào)控研究.pdf

1、第一部分SSc患者和正常人皮膚Fb克隆分離及膠原合成異質(zhì)性克隆的篩選
　　 目的：分離系統(tǒng)性硬皮病(Systemicscleroderma,SSc)患者和正常人皮膚成纖維細(xì)胞(Fibroblast,Fb)克隆,篩選出膠原合成異質(zhì)性克隆。
　　 方法：以組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行SSc患者和正常人皮膚Fb原代培養(yǎng),采用免疫組化方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定,以改良的有限稀釋法分離、培養(yǎng)Fb克隆,通過原位雜交方法檢測Fb克隆I型前膠原α1鏈(COL

2、1A1)mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：建立5個SSc患者皮膚Fb細(xì)胞系和4個正常人皮膚Fb細(xì)胞系,經(jīng)免疫組化法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為Fb。經(jīng)分離、培養(yǎng)共獲得68個Fb克隆(克隆第四代),包括SSc患者36個Fb克隆和正常人32個Fb克隆。原位雜交法顯示SSc組Fb克隆COL1A1mRNA的平均OD值(6.636±2.480)高于正常對照組(3.693±2.007),t=3.690,P=0.001。通過聚類分析將所有克隆的平均OD值分為

3、高、中、低三組。SSc組和正常對照組Fb克隆高、中、低三組的總體構(gòu)成比不同(P=0.005)。SSc組COL1A1mRN,A高表達(dá)組克隆的比例高于正常對照組。在此基礎(chǔ)上,本課題組另一成員對Fb克隆Ⅰ型前膠原蛋白(免疫印跡和ELISA法)和COL1A1、COL3A1mRNA(實(shí)時定量RT-PCR,Taqman探針法)的測定結(jié)果表明:(1)SSc組Fb克隆COL1A1mRNA與COL3A1mRNA水平的異質(zhì)性較正常對照組大;(2)Fb克?、?/p>

4、型前膠原蛋白表達(dá)與其mRN,A水平呈正相關(guān);(3)Fb克隆的COL1A1mRNA水平與COL3A1mRNA水平呈正相關(guān)。并將Fb克隆分為高、中、低膠原合成組。SSc組高膠原合成克隆的比例及其平均膠原合成量高于正常對照組高膠原合成克隆。
　　 結(jié)論：SSc患者皮膚Fb高膠原合成克隆的比例及其膠原合成增高的幅度大于正常人。
　　 第二部分SSc患者和正常人膠原合成異質(zhì)性Fb克隆的膠原基因轉(zhuǎn)錄特性研究
　　 目的：了解

5、SSc患者和正常人膠原合成異質(zhì)性Fb克隆的膠原基因轉(zhuǎn)錄特性。
　　 方法：構(gòu)建含人COL1A1和COL3A1基因啟動子片段的重組質(zhì)粒,采用瞬時轉(zhuǎn)染法、雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)測定COL1A1和COL3A1基因啟動子在膠原合成異質(zhì)性Fb克隆中的活性。通過染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析法結(jié)合定量PCR法檢測轉(zhuǎn)錄因子Sp1與不同F(xiàn)b克隆COL1A1基因近端啟動區(qū)的結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測序鑒定,所有重組質(zhì)

6、粒構(gòu)建正確。經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染、報告基因測活發(fā)現(xiàn)COL1A1-174bp～+42bp、COL3A1-96bp～+16bp在不同F(xiàn)b克隆中具有相對最高或較高的活性,并且其活性分別與Fb克?、裥?Ⅲ型前膠原表達(dá)呈正相關(guān)。ChIP、定量PCR結(jié)果顯示,Sp1與高膠原合成克隆COL1A1近端啟動區(qū)-174bp～+42bp的結(jié)合活性高于低膠原合成克隆(P＜0.05),這種差異在SSc組較正常對照組更為明顯(F=24.569,P=0.000)。
　　

7、 結(jié)論：SSc患者高膠原合成Fb克隆的Ⅰ型、Ⅲ型前膠原基因在轉(zhuǎn)錄水平即被激活;轉(zhuǎn)錄因子Sp1可能參與上調(diào)SSc患者高膠原合成Fb克隆COL1A1-174bp～+42bp啟動片段的活性。
　　 第三部分細(xì)胞因子和丹參對SSc患者膠原合成異質(zhì)性Fb克隆膠原基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
　　 目的：研究細(xì)胞因子、丹參及其單體對SSc患者膠原合成異質(zhì)性Fb克?、裥?、Ⅲ型前膠原基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　 方法：以瞬時轉(zhuǎn)染方法將含有人COL

8、1A1-174bp～+42bp、COL3A1-96bp～+16bp啟動片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SSc患者和正常人膠原合成異質(zhì)性Fb克隆,施加細(xì)胞因子、丹參及其單體干預(yù)48h后,通過雙熒光素酶報告基因檢測技術(shù)測定COL1A1和COL3A1近端啟動區(qū)的活性。
　　 結(jié)果：TGF-β1(5ng/mL)、CTGF(20ng/mL)上調(diào)COL1A1、COL3A1近端啟動區(qū)在SSc患者和正常人Fb克隆中的活性,其中CTGF在SSc患者優(yōu)先上調(diào)CO

9、L3A1近端啟動區(qū)在低膠原合成Fb克隆中的活性。丹參注射液(1mg/mL)、丹參酮ⅡA(5μg/mL)抑制COL1A1、COL3A1近端啟動區(qū)在SSc患者和正常人Fb克隆中的活性,并且優(yōu)先下調(diào)兩者在SSc患者高膠原合成Fb克隆中的活性;原兒茶醛(5μg/mL)和丹酚酸B(5μg/mL)分別選擇性抑制COL1A1和COL3A1近端啟動區(qū)在Fb克隆中的活性。未發(fā)現(xiàn)IFN-γ(100ng/mL)、丹參素鈉(20μg/mL)抑制COL1A1和C