Ikaros不同可變剪切體對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、分類(lèi)號(hào)：密級(jí)：UDC：學(xué)號(hào)：T104112015021033南昌大學(xué)同等學(xué)力申請(qǐng)碩士學(xué)位研究生學(xué)位論文Ikaros不同可變剪切體對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響不同可變剪切體對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響EffectsofdifferentIkarosisofmsoncellproliferationapoptosis易麗君培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院指導(dǎo)教師姓名、職稱(chēng)：曾小平副教授申請(qǐng)學(xué)位的學(xué)科門(mén)類(lèi)：醫(yī)學(xué)學(xué)科專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：免疫學(xué)論文答辯日期：20

2、18年5月31日答辯委員會(huì)主席：評(píng)閱人：年月日摘要摘要目的目的通過(guò)分析兒童急性淋巴細(xì)胞白血病臨床骨髓樣本中Ikaros的不同表現(xiàn)亞型，初步探討Ikaros缺失性突變(功能缺失)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及引起多藥耐藥的可能分子機(jī)制，為兒童ALL的個(gè)性化治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。方法方法(1)收集110例2013年2015年在江西省兒童醫(yī)院確診的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患兒的骨髓樣本，所收集的樣本均獲得患兒家屬及醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。(2)利用淋

3、巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，巢式PCR及克隆測(cè)序分析確定患兒Ikaros的表達(dá)亞型，分析Ikaros表達(dá)亞型與臨床其它實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的相關(guān)性，并且統(tǒng)計(jì)Ikaros異常表型與預(yù)后的相關(guān)性。(3)以IK1作為Ikaros功能型代表，以IK6為Ikaros無(wú)功能型代表，通過(guò)構(gòu)建Ikaros功能型型和無(wú)功能型表達(dá)載體，在人胚腎293T細(xì)胞株中，按照轉(zhuǎn)染試劑Lip2000說(shuō)明書(shū)的操作流程，將pcD

4、NA3.1vect、pcDNA3.1IK1、pcDNA3.1IK6分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞提取總蛋白，免疫蛋白印跡法(westernblotWB)檢測(cè)IK1和IK6，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖率，WB檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl2的表達(dá)水平，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子caspase3水平，通過(guò)各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，說(shuō)明IK1和IK6對(duì)293T細(xì)胞增殖和凋亡生物學(xué)行為的影響。同時(shí)通過(guò)qPCR熒光定量檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞凋亡

5、相關(guān)基因(BCL2、BAX)的表達(dá)水平，比較缺失突變型Ikaros對(duì)細(xì)胞的影響。分析Ikaros功能狀態(tài)影響PI3KAKT信號(hào)通路的分子機(jī)制及參與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。經(jīng)pubmed序列比對(duì)，設(shè)計(jì)引入酶切位點(diǎn)（BamHI和XhoI）的Ikaros引物，PCR擴(kuò)增，經(jīng)膠回收后與表達(dá)載體pcDNA3.1表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，利用T4連接酶連接，對(duì)可疑陽(yáng)性重組子的基因序列測(cè)序鑒定。(4)慢病毒包裝GV3583FLAGEGFPPUROIK6(L