纈沙坦與阿托伐他汀對心肌梗死后室性心律失常的影響及機制研究.pdf

1、在課題組既往研究基礎上，本研究擬通過建立MI動物模型，進一步證實縫隙連接重構、交感神經(jīng)重構與VAs的關系，探討MI后巨噬細胞表型轉化與心臟交感神經(jīng)重構的關系;并給予ARB纈沙坦、他汀類代表藥物阿托伐他汀干預，以期揭示二者抗心律失常作用及可能機制，為降低MI后VAs的發(fā)生提供新的思路，并為臨床上MI后ARB、他汀類藥物的早期應用提供進一步的理論依據(jù)。為明確闡述以上問題，本課題通過以下兩個部分進行探討:
　　第一部分 纈沙坦對心肌梗死

2、后室性心律失常的影響及機制的實驗研究
　　目的:
　　明確MI后縫隙連接重構與VAs的關系，并行ARB纈沙坦干預研究，確定其具有抗心律失常作用，以期為MI后VAs的防治及ARB的臨床拓展應用提供新的思路。
　　方法:
　　SD大鼠隨機分成3組:假手術組（Sham組），心肌梗死組（MI組），ARB纈沙坦干預心肌梗死組（ARB組）。采用開胸結扎左冠狀動脈制造MI大鼠模型，術后次日分別予以等容積生理鹽水及纈沙坦(30

3、mg/kg/day)灌胃。繼續(xù)喂養(yǎng)至8周，所有存活大鼠均行血流動力學檢查，并接受活體程序電刺激試驗以誘發(fā)VAs。每組各選取10只大鼠處死后立即取梗死灶周、非梗死左室游離壁(left ventricle free wall，LVFW)，利用免疫組織化學、Westernblot及透射電鏡等方法觀察Cx43的分布及數(shù)量;剩余各組大鼠行心室肌細胞分離，利用膜片鉗技術記錄心室肌細胞瞬時外向鉀電流(transientoutward potassiu

4、m current,Ito)電流密度并進行統(tǒng)計學分析，以評價縫隙連接通道的功能。
　　結果:
　　1.MI組大鼠VAs誘發(fā)率較Sham組顯著增加(P＜0.01);射血分數(shù)(ejectionfraction，EF)和心輸出量(cardiac output，CO)較Sham組顯著下降(P＜0.05)，左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)和左室內壓最大上升/下降速率(±dp/

5、dtmax)亦顯著降低(P＜0.05);免疫組織化學顯示與Sham組相應部位相比，梗死灶周心肌組織Cx43分布不均一，含量降低（0.215±0.017，0.330±0.024，P＜0.05），心室肌細胞Ito電流密度下降。
　　2.與MI組相比，ARB組VAs誘發(fā)率顯著下降(P＜0.01);EF和CO顯著升高，±dp/dtmax亦顯著上升（P＜0.05），而左心室舒張末壓力(left ventricleend-diastolic

6、pressure，LVEDP)、LVSP下降(P＜0.05);梗死灶周心室Cx43含量增加（0.330±0.024，P＜0.05）、分布不均一的程度減輕，Ito電流密度部分恢復。
　　3.在LVFW，三組Cx43分布方式相對正常，但MI組Cx43含量與Sham組和ARB組相比顯著下降（P＜0.05），而在Sham組和ARB組之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。
　　4.Western blot結果同上述;同時，電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，ARB纈沙坦干預

7、可在一定程度上恢復心肌梗死后異常的Cx43分布。
　　結論:
　　1.MI后縫隙連接表現(xiàn)出數(shù)量的減少，空間分布的異常及功能的改變等，即縫隙連接重構，使心肌組織電傳導的一致性喪失，其是導致MI后VAs發(fā)生的機制之一;
　　2.MI后ARB纈沙坦干預能有效改善MI所致的縫隙連接重構，部分恢復下降的Ito電流密度，從而降低MI后VAs的易感性和發(fā)生率。
　　第二部分 阿托伐他汀對心肌梗死后室性心律失常的影響及機制的實驗

8、研究
　　目的:
　　探討MI后巨噬細胞表型轉化與交感神經(jīng)重構的關系，明確他汀類藥物阿托伐他汀干預對MI后巨噬細胞表型的影響及與MI后交感神經(jīng)重構的關系，為MI后由交感神經(jīng)重構引發(fā)的惡性心律失常的防治提供新的靶點，并為他汀類藥物在臨床的拓展應用提供理論依據(jù)和基礎實驗支持。
　　方法:
　　Wistar大鼠隨機分為3組:假手術組（Sham組），心肌梗死組（MI組），他汀類代表藥物阿托伐他汀干預心肌梗死組（Stati

9、n組）。開胸行左冠狀動脈結扎制造大鼠MI模型，術后當日分別給以等容積PBS溶液及阿托伐他汀(10mg/kg/day)灌胃。7天后，所有成活動物行程序性電刺激誘發(fā)VAs。分離大鼠腹腔巨噬細胞分別給以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）+干擾素γ(interferionγ,IFN-γ）和白介素4(interleukin-4，IL-4)誘導細胞極化，選組1孔板LPS+IFN-γ誘導刺激的巨噬細胞給以阿托伐他汀干預，并利用流

10、式細胞儀檢測巨噬細胞極性，實時定量RT-PCR檢測M1型巨噬細胞分泌的誘導型一氧化氮合成酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)、M2型巨噬細胞分泌的精氨酸酶1(arginase1，Arg1)、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）相應mRNA的表達;利用免疫組織化學和免疫熒光染色的方法觀察MI后梗死灶周巨噬

11、細胞浸潤情況及生長相關蛋白43(growth associated protein43，GAP43)和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性神經(jīng)纖維的密度與分布;Western blot檢測心肌組織中NGF蛋白表達;實時定量RT-PCR檢測心肌中NGF相應mRNA的表達;ELISA檢測血清中NGF濃度。
　　結果:
　　1.對于分離的腹腔巨噬細胞，流式細胞儀檢測提示LPS+IFN-γ和IL-4分別

12、成功誘導刺激巨噬細胞向M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞轉化;LPS+IFN-γ誘導刺激的細胞給以阿托伐他汀干預后，CD86/CD68雙染陽性表達率（CD86為M1型巨噬細胞標記物，CD68巨噬細胞為標記物）顯著下降，提示阿托伐他汀確實可促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化。
　　2.對于分離的腹腔巨噬細胞，LPS+IFN-γ和IL-4誘導刺激組iNOS和Arg1水平與對照組比較顯著不同(P＜0.01)，提示巨噬細胞極性誘導轉化成功

13、。與對照組相比，LPS+IFN-γ誘導刺激組IL-1β、TNF-α相應mRNA表達和IL-4誘導刺激組IL-1β、TNF-α相應mRNA表達顯著升高(P＜0.01);但IL-4誘導刺激組二者表達水平低于LPS+IFN-γ誘導刺激組。LPS+IFN-γ誘導刺激的細胞給予阿托伐他汀干預后可明顯升高Arg1表達;并逆轉IL-1β、TNF-α相應mRNA的升高趨勢(P＜0.01)，提示阿托伐他汀干預后成功誘導M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化。

14、
　　3.巨噬細胞浸潤:MI組梗死灶周存在大量CD68陽性巨噬細胞，且數(shù)量顯著高于Sham組(P＜0.01);CD163/CD68雙染來標記M2型巨噬細胞(CD163為M2型巨噬細胞標記物)，其在MI后第3天可計數(shù)到;與MI組相比，Statin組梗死灶周CD163陽性細胞計數(shù)顯著增加（P＜0.01），證實在MI后早期給以阿托伐他汀干預可促進巨噬細胞表型從M1型向M2型的轉化。
　　4.NGF蛋白及mRNA表達:與Sham相比

15、，MI組NGF表達明顯上調;給以阿托伐他汀干預后，NGF表達明顯下調。同時，NGF陽性的巨噬細胞數(shù)量明顯下降。
　　5.神經(jīng)支配:(1)GAP43陽性神經(jīng)纖維:Sham組幾乎不可見;與Sham組相比，MI組梗死灶周神經(jīng)纖維密度顯著增加;與MI組相比，Statin組神經(jīng)密度顯著降低;(2)TH陽性神經(jīng)纖維:Sham組可見其與心肌纖維一致的走形，分布均勻;與Sham組相比，MI組梗死灶周神經(jīng)密度顯著增加，且形態(tài)異常、空間分布混亂;與M