RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)ABP-5基因?qū)θ烁伟〩epG2細胞和裸鼠移植瘤生長的影響.pdf

1、目的：探討RNA干擾(RNA interference)介導(dǎo)表皮脂肪酸結(jié)合蛋白(fattyacid binding protein-5，F(xiàn)ABP-5)基因沉默的重組慢病毒載體(LV-shRNA-FABP5)對人肝癌細胞株HepG2的細胞增殖和基因表達、細胞周期和凋亡變化情況、細胞侵襲能力改變和裸鼠成瘤情況的影響。
　　方法：1.RT-PCR方法分別檢測在人肝癌細胞系HepG2、SK-HEP-1和SMMC-7721細胞中FABP-5

2、 mRNA的表達量，篩選目的細胞。
　　2.RNA干擾技術(shù)設(shè)計合成3個特異性靶向FABP-5基因的shRNA重組慢病毒載體(FABP5-shRNA表達載體)，轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細胞，對不同靶點進行篩選。
　　3.實驗分為三組。FABP-5基因沉默重組慢病毒顆粒(LV-shRNA-FABP5)轉(zhuǎn)染HepG2細胞作為實驗組(Knock Down，KD);空載體重組慢病毒顆粒(LV-shRNA-NC)轉(zhuǎn)染HepG2細胞作為陰性

3、對照組(Negative Control，NC);空白對照組(Control)為正常條件下培養(yǎng)HepG2細胞。采用RT-PCR及免疫蛋白印記法檢測FABP-5 mRNA及蛋白的表達。
　　4.MTT法檢測細胞增殖能力;Giemsa染色法觀察各組細胞的克隆形成情況;細胞侵襲實驗檢測細胞體外侵襲能力;流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化和細胞凋亡情況。
　　5.將實驗組、陰性對照組及空白對照組的細胞分別接種于裸鼠右腋皮下0.5cm處，構(gòu)建

4、裸鼠肝癌移植瘤模型。連續(xù)4周觀察裸鼠的成瘤情況、移植瘤大小及體積變化，繪制裸鼠移植瘤生長曲線。采用小動物活體成像儀觀察裸鼠肝癌移植瘤的生長狀況。4周后處死裸鼠，稱量移植瘤的重量及計算瘤體體積。RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)法測定腫瘤組織中FABP-5基因的mRNA及蛋白的相對表達量。
　　結(jié)果：1.RT-PCR結(jié)果提示FABP5在SMMC-7721中的表達豐度做敲減實驗存在風(fēng)險，在HepG2、SK-HEP-1

5、中的表達豐度滿足敲減實驗要求。而HepG2細胞中表達豐度最高，篩選出人肝癌細胞HepG2作為目的細胞。
　　2.成功構(gòu)建了FABP5基因沉默的慢病毒載體。轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細胞中，觀察得到轉(zhuǎn)染效率均＞90％以上。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示:三個實驗組相對于空白對照組和陰性對照組，F(xiàn)ABP-5 mRNA的表達量減少均＞50％以上，其中LV-shRNA-FABP5(1)組(即1號靶點)FABP-5表達的敲減率最高，達85

6、％以上(P＜0.05)。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于陰性對照組，LV-shRNA-FABP5(1)靶點的FABP-5蛋白表達減少88.28％(P＜0.05)，將此組作為實驗組。
　　4.MTT法結(jié)果得到A490值分別在第1、2、3、4和5d時，空白對照組和陰性對照組均明顯高于實驗組（P＜0.05）。Giemsa染色法檢測發(fā)現(xiàn)實驗組的克隆形成數(shù)(12±2)明顯低于空白對照組(149±10)及陰性對照組(146±11)，實驗

7、組細胞增殖能力明顯受到抑制（P＜0.05）。細胞侵襲實驗得出，實驗組細胞侵襲轉(zhuǎn)移率（0.87％±0.11％）相比空白對照組（3.45％±0.12％）和陰性對照組（3.37％±0.06％），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果:相比空白對照組和陰性對照組，實驗組G1期比例降低，S期和G2/M期比例增高（P均＜0.05）。實驗組中HepG2細胞凋亡率（26.88％±0.11％）明顯高于陰性對照組（2.13％±0.36％）

8、，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.裸鼠接種肝癌HepG2細胞后，三組裸鼠右腋下均有肉眼可見的腫瘤長出，成瘤率100％，結(jié)果顯示實驗組移植瘤的生長及成瘤能力明顯減慢(P＜0.05)。4周后測量空白對照組、陰性對照組、實驗組的腫瘤組織平均體積分別為:(100.51±47.45)mm3、(104.02±52.89)mm3、(29.41±8.98)mm3(P＜0.05);空白對照組、陰性對照組、實驗組的瘤體平均重量分別為:(

9、0.632±0.203)g、(0.629±0.226)g、(0.204±0.067)g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RT-PCR、Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)FABP-5在實驗組中mRNA和蛋白表達量低于空白對照組和陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)提示FABP-5蛋白表達情況基本和Western blot結(jié)果相符，在裸鼠肝癌移植瘤組織中表達FABP-5陽性信號定位于在細胞核和（或）細胞漿中表達，相

10、比于空白對照組及陰性對照組，實驗組FABP-5陽性表達率明顯降低，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論：1.FABP-5基因的RNAi重組體可以有效抑制FABP-5基因的mRNA和蛋白的表達。
　　2.人肝癌HepG2細胞中FABP-5基因沉默后細胞增殖受到抑制，癌細胞侵襲力降低，細胞凋亡明顯增加，細胞周期阻滯于G2/M期。
　　3.RNA干擾技術(shù)沉默HepG2細胞中FABP-5基因可以明顯抑制人肝癌裸鼠