抗氯霉素單克隆抗體的制備及一步式化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法的建立.pdf

1、氯霉素(Chloramphenicol，CAP)作為一種有效的廣譜抗生素，曾廣泛的應(yīng)用于畜牧業(yè)。但由于氯霉素對人類具有嚴(yán)重的毒副作用，被世界各國明令禁止在食品動(dòng)物中使用。為了嚴(yán)格控制氯霉素殘留情況，建立一種高效、靈敏、快速、特異的藥物殘留檢測技術(shù)成為當(dāng)務(wù)之急?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)具有化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)的高靈敏度與免疫反應(yīng)的高特異性等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床檢測中所有酶免疫分析和放射免疫分析的檢測項(xiàng)目，是這兩種方法的替代升級產(chǎn)品，具有較好的發(fā)展前

2、景。
　　 本研究以人工合成的氯霉素-牛血清白蛋白(CAP-HS-BSA)免疫BALB/c小鼠；三免后，以間接ELISA方法測定免疫小鼠的血清效價(jià)，均達(dá)到1:1.28×105，說明小鼠獲得了較好的免疫效果；取效價(jià)最高的免疫小鼠的血清進(jìn)行間接競爭ELISA測定，血清半抑制濃度(IC50)在100～1000μg/L之間。
　　 采用細(xì)胞融合技術(shù)將效價(jià)最高的小鼠免疫脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，融合率為22.9％。經(jīng)過間接E

3、LISA篩選，獲得分泌抗CAP的強(qiáng)陽性雜交瘤細(xì)胞株1株，經(jīng)克隆3次后，選擇細(xì)胞生長狀態(tài)良好，克隆陽性率達(dá)100％的細(xì)胞株，命名為5D7。
　　 對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行了效價(jià)測定與亞類鑒定，分泌的抗體亞類為IgGl、k鏈，細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1:512。采用體內(nèi)誘生腹水的方法制備單克隆抗體，純化后對抗體進(jìn)行了效價(jià)、親和性和特異性測定。結(jié)果顯示，腹水經(jīng)純化后效價(jià)為1:2×105，親和常數(shù)為3.6×108L/mo1，與L-苯丙氨酸、L

4、-酪氨酸、青霉素、四環(huán)素、慶大霉素等結(jié)構(gòu)類似物及常見抗生素的交叉反應(yīng)率小。
　　 利用制備的抗CAP單克隆抗體5D7建立了一步式檢測氯霉素的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法，并進(jìn)一步優(yōu)化抗原包被條件、抗體工作濃度、競爭反應(yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，獲得CLEIA的線性回歸方程為y=-12.188x+62.988，R2=0.9909，IC50=11.63μg/L，該方法顯示在0.001～10μg/L有較好的線性關(guān)系，檢出限為0.0061μg/L，回收率