通過(guò)秀麗線蟲(chóng)研究線粒體應(yīng)激對(duì)ROS產(chǎn)生及衰老的影響.pdf

1、線粒體是細(xì)胞ATP產(chǎn)生，三羧酸循環(huán)，脂類、鐵硫簇、血紅素合成的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源。線粒體功能與細(xì)胞的生存與代謝密切相關(guān)，線粒體參與了自噬，凋亡，細(xì)胞分裂，信號(hào)傳遞等幾乎所有的生化過(guò)程。線粒體功能的紊亂可以導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，如費(fèi)氏共濟(jì)失調(diào)、阿爾茨海默癥、帕金森病、糖尿病、Leber視神經(jīng)病等。線粒體作為ROS的主要來(lái)源，也被認(rèn)為與衰老的發(fā)生有關(guān)。衰老的自由基假說(shuō)認(rèn)為自由基可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)大分子如蛋白質(zhì)、脂類、DNA造成

2、損傷，引起細(xì)胞功能紊亂，最終導(dǎo)致衰老。清除自由基的超氧化物歧化酶的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明細(xì)胞有專門應(yīng)對(duì)ROS的機(jī)制，是這一假說(shuō)的重要證據(jù)。不過(guò)，這一假說(shuō)目前還是存在爭(zhēng)議。
　　本研究采用線蟲(chóng)為模型，發(fā)現(xiàn)PQ對(duì)線蟲(chóng)的ROS影響是復(fù)雜的。只給予30分鐘的短暫刺激，線蟲(chóng)的ROS確實(shí)是增加的，這與文獻(xiàn)報(bào)道“PQ可以誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS”的結(jié)論是一致的。但是，從卵開(kāi)始孵化就生活在PQ環(huán)境中的線蟲(chóng)，無(wú)論是活體染色還是裂解后測(cè)定，或者提取線粒體后測(cè)定，ROS及超氧

3、離子相對(duì)未經(jīng)PQ處理組都是降低的。通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照的實(shí)驗(yàn)，即紫外照射及熱激后測(cè)定線蟲(chóng)ROS及超氧離子發(fā)現(xiàn)是上升的，證明了我們測(cè)定方法的可靠性。我推測(cè)在慢性PQ處理下，一些保護(hù)性的機(jī)制會(huì)激活，從而有助線蟲(chóng)適應(yīng)不利的環(huán)境，增加對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力，進(jìn)而引起ROS及超氧離子的降低。通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)慢性PQ處理下sod-3， gst-4，hsp-6等清除自由基或者維持細(xì)胞蛋白穩(wěn)態(tài)的基因的表達(dá)是上調(diào)的。PQ慢性處理過(guò)的線蟲(chóng)對(duì)高滲透壓，高溫，以及高強(qiáng)度氧化應(yīng)

4、激的抵抗力明顯強(qiáng)于未經(jīng)PQ處理過(guò)的線蟲(chóng)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)sod-2， sod-3及daf-16與ROS的減少密切相關(guān)，當(dāng)這些基因突變時(shí)，PQ慢性處理后ROS不僅不會(huì)降低而且相對(duì)未處理組還會(huì)升高。自由基衰老理論認(rèn)為自由基對(duì)蛋白質(zhì)，脂類，DNA等大分子的損傷作用導(dǎo)致了細(xì)胞功能紊亂與衰老的發(fā)生。然而，最近有一些文獻(xiàn)報(bào)道適當(dāng)濃度的PQ慢性處理可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命。本人也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，本研究采用了PQ濃度從低到高的七個(gè)處理，即0，0.03，0.0

5、5，0.1，0.2，0.3，0.5mM PQ處理組。發(fā)現(xiàn)在0.3mM PQ慢性處理下線蟲(chóng)的壽命是明顯延長(zhǎng)的，這與文獻(xiàn)報(bào)道適當(dāng)?shù)陌俨菘萏幚砜梢匝娱L(zhǎng)壽命的結(jié)論也是一致的。然而，此前的報(bào)道籠統(tǒng)的把“壽命”延長(zhǎng)混淆于線蟲(chóng)的“衰老”延緩。本人在研究中發(fā)現(xiàn)，0.3mM PQ雖然延長(zhǎng)了壽命約兩天，但是卻使得從卵到生長(zhǎng)停止的時(shí)間“膨脹”了四天。我們很難說(shuō)從卵開(kāi)始線蟲(chóng)就步入了“衰老”過(guò)程。如果從停止生長(zhǎng)開(kāi)始算衰老起點(diǎn)的話，0.3mM PQ反而是加速衰老的

6、。如果把推遲發(fā)育這一因素考慮進(jìn)去，0.1mM以上的PQ處理都是促進(jìn)衰老的。0.03，0.05mM PQ由于濃度太低，沒(méi)有對(duì)壽命造成明顯的影響。本文進(jìn)一步提供了其他證據(jù)證明PQ慢性處理可以促進(jìn)衰老，即等線蟲(chóng)停止發(fā)育后再對(duì)其進(jìn)行PQ處理，發(fā)現(xiàn)隨著PQ濃度的增加壽命有越來(lái)越短的趨勢(shì)。而且無(wú)論從卵還是從成蟲(chóng)開(kāi)始對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行PQ慢性處理都加速了衰老伴隨的運(yùn)動(dòng)能力的下降。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PQ慢性處理加速了衰老。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)線粒體mtDNA拷貝數(shù)及ATP

7、合成并未降低。因此， ROS的降低不是由于線粒體數(shù)量的減少及功能紊亂造成的，而是由于清除ROS能力的增強(qiáng)。PQ慢性處理后ROS雖然降低了，但是線蟲(chóng)卻衰老的加快了。然而，線粒體呼吸鏈亞基編碼基因nuo-6的RNA干擾也降低了ROS，但其壽命卻是明顯延長(zhǎng)的，衰老也是延緩的，綜合這兩種情況提示ROS不能直接導(dǎo)致衰老的加快或延緩。PQ對(duì)于細(xì)胞或線蟲(chóng)來(lái)說(shuō)是一種不利的外界因素，它可以導(dǎo)致線粒體功能紊亂及穩(wěn)態(tài)的失衡。編碼線粒體蛋白的基因突變對(duì)線蟲(chóng)是一

8、種不利的內(nèi)部因素，它也會(huì)影響線蟲(chóng)的正常代謝活動(dòng)及破壞線粒體穩(wěn)態(tài)。當(dāng)這些編碼線粒體的重要蛋白的基因突變或?qū)ζ溥M(jìn)行RNAi處理時(shí)，線蟲(chóng)體內(nèi)會(huì)激活一系列的保護(hù)性機(jī)制，包括未折疊蛋白反應(yīng)（即UPRmt），GCN-2介導(dǎo)的蛋白翻譯途徑，HIF-1介導(dǎo)的低氧應(yīng)答機(jī)制等，這同PQ處理的情況類似，后者也激活UPRmt，GCN-2通路等。然而，基因突變或干擾造成的線粒體功能紊亂很多時(shí)候可以延長(zhǎng)壽命，UPRmt，GCN-2，HIF-1等通路被認(rèn)為與壽命延長(zhǎng)

9、有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)這些保護(hù)性機(jī)制的激活只是一種對(duì)不利內(nèi)部環(huán)境的反饋性的應(yīng)答，增加了線蟲(chóng)對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力，這些保護(hù)性的機(jī)制本身不是壽命延長(zhǎng)的原因。如UPRmt的激活不能延長(zhǎng)壽命，它的阻斷對(duì)呼吸鏈亞基nuo-6， cco-1 RNAi介導(dǎo)的壽命延長(zhǎng)沒(méi)有影響。同樣的，GCN-2及HIF-1的缺失也對(duì)壽命延長(zhǎng)沒(méi)有影響。UPRmt等保護(hù)性機(jī)制雖然在PQ慢性處理下都是激活的，但線蟲(chóng)卻是加速衰老的，同樣暗示了保護(hù)性機(jī)制不是導(dǎo)致壽命延長(zhǎng)的原因。隨著衰