沙門(mén)氏菌及其致病性血清型分子檢測(cè)技術(shù)研究及在食品中的應(yīng)用.pdf

1、沙門(mén)氏菌是最常見(jiàn)的食源性致病之一，由該菌引起的食物中毒病例在世界范圍內(nèi)居于首位。該菌有2600多個(gè)血清型，分布具有地域性的特點(diǎn)。針對(duì)沙門(mén)氏菌血清型的檢測(cè)是非常必要的，傳統(tǒng)檢測(cè)方法是利用國(guó)標(biāo)的方法。該檢測(cè)方法程序復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)而且檢測(cè)成本較高，不能滿(mǎn)足食品生產(chǎn)企業(yè)和質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)部門(mén)快速檢測(cè)的要求。因此，建立一種直接針對(duì)血清型的分子快速檢測(cè)方法就顯得非常重要。
　　本研究是通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)和比較基因組的方法，分別篩選到了腸炎沙門(mén)氏菌、

2、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌、都柏林沙門(mén)氏菌和海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌的特異性基因，并以此分別建立了多重PCR檢測(cè)體系、real-timePCR檢測(cè)體系和real-time NASBA檢測(cè)。主要研究結(jié)果分述如下:
　　1，6種沙門(mén)氏菌常見(jiàn)血清型分子檢測(cè)靶點(diǎn)的發(fā)掘
　　首先選取沙門(mén)氏菌6個(gè)常見(jiàn)血清型的代表菌株并通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得該菌株的全基因組序列的信息，分別是鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2(NC_00319

3、7.1)、腸炎沙門(mén)氏菌P125109(NC_011294.1)、乙型副傷寒沙門(mén)氏菌SPB7(NC_011205.1)、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌RKS4594(NC_012125.1)、都柏林沙門(mén)氏菌CT_02021853(NC_011205.1)和海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌SL476(NC_011083.1)。再將以上各個(gè)菌株的每個(gè)基因進(jìn)行BLASTN程序的比對(duì)，選擇與本血清型同源性較高，同時(shí)與其它血清型同源性較低的基因作為血清型準(zhǔn)特異性基因。各個(gè)血清

4、型分別獲得8、12、18、7、15和10個(gè)的準(zhǔn)特異性基因。并以此為模板設(shè)計(jì)引物，利用實(shí)驗(yàn)室保存的48株沙門(mén)氏菌和18株非沙門(mén)氏菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明:鼠傷寒沙門(mén)氏菌獲得2個(gè)血清型特異性基因hsdS和STM4494，腸炎沙門(mén)氏菌獲得3個(gè)血清型特異性基因kil、SEN1382和SEN1383，乙型副傷寒沙門(mén)氏菌獲得3個(gè)血清型特異性基因SPAB_01122、SPAB_01123和SPAB_01124，丙型副傷寒沙門(mén)氏菌獲得3個(gè)血清型特異性

5、基因SPC_0871、SPC_0872和SPC_0908，都柏林沙門(mén)氏菌獲得2個(gè)血清型特異性基因SeD_A1118和SeD_A2283，海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌獲得4個(gè)血清型特異性基因SeHA_C2639、SeHA_C2640、SeHA_C3258和SeHA_C3259。同時(shí)又對(duì)每個(gè)血清型特異性引物的靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)，各個(gè)引物的靈敏度均在98.33ng/μl-140 fg/μl之間。血清型特異性基因功能分析，75％的特異性基因是編碼的蛋白參與細(xì)

6、胞的物質(zhì)代謝過(guò)程，只有個(gè)別基因是編碼膜蛋白、血清型抗原合成蛋白和與噬菌體相關(guān)的蛋白。
　　2，單一沙門(mén)氏菌血清型的多重PCR檢測(cè)方法的建立
　　以SPAB_01124和invA基因作為靶點(diǎn)，建立乙型副傷寒沙門(mén)氏菌和沙門(mén)氏菌屬檢測(cè)的雙重PCR檢測(cè)方法。當(dāng)反應(yīng)體系分別獲得為284bp和384bp時(shí)，該檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。使用48株沙門(mén)氏菌和18株非沙門(mén)氏菌對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了特異性測(cè)試，結(jié)果表明只有乙型副傷寒沙門(mén)氏菌獲得兩條擴(kuò)增片段，

7、而其他菌株只獲得一條或沒(méi)有擴(kuò)增片段均為陰性，特異性達(dá)到100％。該體系的DNA靈敏度能達(dá)到1.91ng/ul;在經(jīng)過(guò)10h增菌培養(yǎng)后，純菌的菌落靈敏度為2.2 cfu/ml，人工污染牛奶樣品的檢測(cè)限小于10cfu/10ml。而且該檢測(cè)方法對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有一定的抵抗能力。
　　以SeD_A1118、SeD_A2283和invA基因作為靶點(diǎn)，建立都柏林沙門(mén)氏菌和沙門(mén)氏菌屬檢測(cè)的多重PCR檢測(cè)方法。當(dāng)反應(yīng)體系分別獲得284

8、bp、378bp和463bp時(shí)，該檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。利用48株沙門(mén)氏菌和18株非沙門(mén)氏菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明只有都柏林沙門(mén)氏菌同時(shí)獲得三條擴(kuò)增片段，特異性達(dá)到100％。當(dāng)模板濃度小于1.87 pg/μl時(shí)，該體系不能同時(shí)獲得3條擴(kuò)增片段，該體系DNA靈敏度為1.87 pg/μl。通過(guò)10h的增菌培養(yǎng)，該方法的菌落靈敏度為10 c fu/ml。用N×103 cfu/ml-N×10-1 cfu/ml的大腸桿菌或腸炎沙門(mén)氏菌與102cfu/

9、ml的都柏林沙門(mén)氏菌共同培養(yǎng)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果表明在以上濃度的干擾菌不能影響到最終的檢測(cè)結(jié)果。人工污染牛奶樣品，經(jīng)過(guò)LB液體培養(yǎng)基37℃增菌8h，檢測(cè)限可以小于10 cfu/10ml。
　　以SeHA_C2640、SeHA_C3259和invA基因作為靶點(diǎn)，建立海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌和沙門(mén)氏菌屬檢測(cè)的多重PCR檢測(cè)方法。當(dāng)反應(yīng)體系分別獲得2121bp、284bp和589bp時(shí)，該檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。利用48株沙門(mén)氏菌和18株非沙門(mén)氏菌進(jìn)

10、行特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明特異性達(dá)到100％。該反應(yīng)體系的DNA靈敏度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，當(dāng)模板濃度為1.4ng/μl時(shí)，能同時(shí)獲得3條擴(kuò)增片段;當(dāng)模板濃度降到1.4 fg/μl，只能同時(shí)獲得139-141和pHAm9引物的擴(kuò)增片段。經(jīng)過(guò)10h增菌培養(yǎng)后，即使初始的菌體濃度為3.8×10-1cfu/ml時(shí)，該方法可以獲得3條擴(kuò)增片段。當(dāng)大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的干擾濃度達(dá)到104 cfu/ml，也不會(huì)影響對(duì)目標(biāo)血清型的檢測(cè)，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有一定

11、的抗干擾能力。人工污染牛奶樣品經(jīng)過(guò)LB液體培養(yǎng)基37℃增菌10h，3對(duì)引物均能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)限達(dá)到3.8 cfu/10ml。
　　3，三種沙門(mén)氏菌血清型多重PCR檢測(cè)方法
　　以SEN1383、STM4494、SPC_0872和invA基因作為靶點(diǎn)，建立腸炎沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、丙型副傷寒沙門(mén)氏菌和沙門(mén)氏菌屬檢測(cè)的多重PCR檢測(cè)方法。當(dāng)反應(yīng)體系分別獲得141bp、534bp、212bp和284bp時(shí)，該檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性

12、。利用48株沙門(mén)氏菌和18株非沙門(mén)氏菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明，特異性達(dá)到100％。通過(guò)10h的增菌培養(yǎng)，該方法對(duì)以上三種血清型菌落靈敏度均小于10 cfu/ml。選取都柏林沙門(mén)氏菌、阿貢納沙門(mén)氏菌和豬霍亂沙門(mén)氏菌作為該檢測(cè)的干擾菌，用N×104cfu/ml-Nc fu/ml的干擾菌分別與102cfu/ml的沙門(mén)氏菌的目標(biāo)血清型共同培養(yǎng)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果表明在該檢測(cè)體系中能抵抗以上3種血清型對(duì)目標(biāo)菌株檢測(cè)的干擾作用。人工污染實(shí)驗(yàn)表明

13、，為了實(shí)現(xiàn)3個(gè)血清型的檢測(cè)限均小于10 cfu/10ml，需經(jīng)過(guò)LB液體培養(yǎng)基37℃增菌12h。
　　4，海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌的real-time PCR檢測(cè)方法
　　以SeHA_C3258和invA基因?yàn)槟０宸謩e設(shè)計(jì)引物和探針(熒光信號(hào)分別為JOE和FAM)，建立海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌和沙門(mén)氏菌屬檢測(cè)的real-time PCR檢測(cè)方法。當(dāng)同時(shí)檢測(cè)到兩個(gè)信號(hào)的擴(kuò)增曲線(xiàn)時(shí)，該檢測(cè)結(jié)果為海德?tīng)柋ど抽T(mén)氏菌陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)48株沙門(mén)氏菌和18

14、株非沙門(mén)氏菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明，特異性達(dá)到100％。該real-time PCR對(duì)基因組的靈敏度為112.4fg/ul;對(duì)純菌增菌培養(yǎng)前和增菌培養(yǎng)后的靈敏度分別為2.4×104cfu/ml和2.4cfu/ml。該檢測(cè)方法在不同濃度模板情況下，變異系數(shù)在0.43-1.15％之間，表明該體系具有較好的重復(fù)性。在雞肉和豬肉背景菌群干擾作用下，該檢測(cè)方法的檢測(cè)限分別為2.54×103cfu/ml和1.7×102cfu/ml，說(shuō)明該檢測(cè)方法

15、具有較好的抗干擾能力。而且，利用試劑盒法提取樣品中的DNA過(guò)程中可以去除樣品中Taq酶反應(yīng)抑制劑，避免檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。在人工污染雞肉和豬肉樣品中，經(jīng)過(guò)LB液體培養(yǎng)基37℃增菌6h，該體系的檢測(cè)限能達(dá)到1 cfu/25g。
　　5，沙門(mén)氏菌及其丙型副傷寒沙門(mén)氏菌real-time NASBA檢測(cè)方法
　　以xcd基因的保守序列作為檢測(cè)靶點(diǎn)，建立沙門(mén)氏菌檢測(cè)的real-time NASBA方法。通過(guò)48株沙門(mén)氏菌和18株非沙

16、門(mén)氏菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明，所有沙門(mén)氏菌能獲得擴(kuò)增曲線(xiàn)，非沙門(mén)氏菌無(wú)熒光信號(hào)被采集，特異性達(dá)到100％。當(dāng)樣品中RNA模板的濃度高于10.5fg/ul時(shí)，該real-time NASBA可獲得有效的擴(kuò)增曲線(xiàn);通過(guò)10h增菌培養(yǎng)，該方法的菌落靈敏度為7×10-1 cfu/ml。該檢測(cè)方法針對(duì)不同血清型的模板及其在不同模板濃度情況下，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.613-2.203之間，表明該體系對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)具有較好的重復(fù)性。提取樣品的總RNA經(jīng)過(guò)

17、DNaseⅠ酶處理，仍能獲得擴(kuò)增曲線(xiàn);但是經(jīng)過(guò)RNase H酶處理，無(wú)任何擴(kuò)增，證明該反應(yīng)是直接針對(duì)于RNA的擴(kuò)增技術(shù)。而且，該方法在對(duì)熱處理24h后死菌的檢測(cè)與國(guó)標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果一致，均呈現(xiàn)陰性。該體系在4.75×107cfu/ml的豬肉背景菌群的干擾下，鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限能達(dá)到9.5×103 cfu/ml，說(shuō)明該方法具有較好的抗干擾能力。人工污染實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)LB培養(yǎng)基37℃增菌10h，在豬肉、牛肉和牛奶中的檢測(cè)限均小于10 cfu

18、/25g(ml)。
　　以SPC_0908和xcd基因作為模板設(shè)計(jì)引物和分子信標(biāo)(JOE和FAM)，建立丙型副傷寒沙門(mén)氏菌和沙門(mén)氏菌檢測(cè)的real-time NASBA方法。通過(guò)48株沙門(mén)氏菌和18株非沙門(mén)氏菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果表明，特異性達(dá)到100％。當(dāng)樣品中RNA模板的濃度高于40.94fg/ul時(shí)，該方法可獲得兩條擴(kuò)增曲線(xiàn);通過(guò)10h增菌培養(yǎng)，該方法的純菌菌落靈敏度和人工污染雞肉和豬肉的靈敏度均小于10cfu/ml。針對(duì)不