沙門氏菌及其致病性血清型分子檢測技術研究及在食品中的應用.pdf

1、沙門氏菌是最常見的食源性致病之一，由該菌引起的食物中毒病例在世界范圍內居于首位。該菌有2600多個血清型，分布具有地域性的特點。針對沙門氏菌血清型的檢測是非常必要的，傳統(tǒng)檢測方法是利用國標的方法。該檢測方法程序復雜、耗時長而且檢測成本較高，不能滿足食品生產企業(yè)和質量監(jiān)督檢驗部門快速檢測的要求。因此，建立一種直接針對血清型的分子快速檢測方法就顯得非常重要。
　　本研究是通過生物信息學技術和比較基因組的方法，分別篩選到了腸炎沙門氏菌、

2、鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌和海德爾堡沙門氏菌的特異性基因，并以此分別建立了多重PCR檢測體系、real-timePCR檢測體系和real-time NASBA檢測。主要研究結果分述如下:
　　1，6種沙門氏菌常見血清型分子檢測靶點的發(fā)掘
　　首先選取沙門氏菌6個常見血清型的代表菌株并通過GenBank數(shù)據(jù)庫獲得該菌株的全基因組序列的信息，分別是鼠傷寒沙門氏菌LT2(NC_00319

3、7.1)、腸炎沙門氏菌P125109(NC_011294.1)、乙型副傷寒沙門氏菌SPB7(NC_011205.1)、丙型副傷寒沙門氏菌RKS4594(NC_012125.1)、都柏林沙門氏菌CT_02021853(NC_011205.1)和海德爾堡沙門氏菌SL476(NC_011083.1)。再將以上各個菌株的每個基因進行BLASTN程序的比對，選擇與本血清型同源性較高，同時與其它血清型同源性較低的基因作為血清型準特異性基因。各個血清

4、型分別獲得8、12、18、7、15和10個的準特異性基因。并以此為模板設計引物，利用實驗室保存的48株沙門氏菌和18株非沙門氏菌進行PCR驗證，結果表明:鼠傷寒沙門氏菌獲得2個血清型特異性基因hsdS和STM4494，腸炎沙門氏菌獲得3個血清型特異性基因kil、SEN1382和SEN1383，乙型副傷寒沙門氏菌獲得3個血清型特異性基因SPAB_01122、SPAB_01123和SPAB_01124，丙型副傷寒沙門氏菌獲得3個血清型特異性

5、基因SPC_0871、SPC_0872和SPC_0908，都柏林沙門氏菌獲得2個血清型特異性基因SeD_A1118和SeD_A2283，海德爾堡沙門氏菌獲得4個血清型特異性基因SeHA_C2639、SeHA_C2640、SeHA_C3258和SeHA_C3259。同時又對每個血清型特異性引物的靈敏度進行了評價，各個引物的靈敏度均在98.33ng/μl-140 fg/μl之間。血清型特異性基因功能分析，75％的特異性基因是編碼的蛋白參與細

6、胞的物質代謝過程，只有個別基因是編碼膜蛋白、血清型抗原合成蛋白和與噬菌體相關的蛋白。
　　2，單一沙門氏菌血清型的多重PCR檢測方法的建立
　　以SPAB_01124和invA基因作為靶點，建立乙型副傷寒沙門氏菌和沙門氏菌屬檢測的雙重PCR檢測方法。當反應體系分別獲得為284bp和384bp時，該檢測結果為陽性。使用48株沙門氏菌和18株非沙門氏菌對該檢測方法進行了特異性測試，結果表明只有乙型副傷寒沙門氏菌獲得兩條擴增片段，

7、而其他菌株只獲得一條或沒有擴增片段均為陰性，特異性達到100％。該體系的DNA靈敏度能達到1.91ng/ul;在經過10h增菌培養(yǎng)后，純菌的菌落靈敏度為2.2 cfu/ml，人工污染牛奶樣品的檢測限小于10cfu/10ml。而且該檢測方法對大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌具有一定的抵抗能力。
　　以SeD_A1118、SeD_A2283和invA基因作為靶點，建立都柏林沙門氏菌和沙門氏菌屬檢測的多重PCR檢測方法。當反應體系分別獲得284

8、bp、378bp和463bp時，該檢測結果為陽性。利用48株沙門氏菌和18株非沙門氏菌進行特異性驗證，結果表明只有都柏林沙門氏菌同時獲得三條擴增片段，特異性達到100％。當模板濃度小于1.87 pg/μl時，該體系不能同時獲得3條擴增片段，該體系DNA靈敏度為1.87 pg/μl。通過10h的增菌培養(yǎng)，該方法的菌落靈敏度為10 c fu/ml。用N×103 cfu/ml-N×10-1 cfu/ml的大腸桿菌或腸炎沙門氏菌與102cfu/

9、ml的都柏林沙門氏菌共同培養(yǎng)，進行PCR反應，結果表明在以上濃度的干擾菌不能影響到最終的檢測結果。人工污染牛奶樣品，經過LB液體培養(yǎng)基37℃增菌8h，檢測限可以小于10 cfu/10ml。
　　以SeHA_C2640、SeHA_C3259和invA基因作為靶點，建立海德爾堡沙門氏菌和沙門氏菌屬檢測的多重PCR檢測方法。當反應體系分別獲得2121bp、284bp和589bp時，該檢測結果為陽性。利用48株沙門氏菌和18株非沙門氏菌進

10、行特異性驗證，結果表明特異性達到100％。該反應體系的DNA靈敏度評價結果表明，當模板濃度為1.4ng/μl時，能同時獲得3條擴增片段;當模板濃度降到1.4 fg/μl，只能同時獲得139-141和pHAm9引物的擴增片段。經過10h增菌培養(yǎng)后，即使初始的菌體濃度為3.8×10-1cfu/ml時，該方法可以獲得3條擴增片段。當大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌的干擾濃度達到104 cfu/ml，也不會影響對目標血清型的檢測，說明該檢測方法具有一定

11、的抗干擾能力。人工污染牛奶樣品經過LB液體培養(yǎng)基37℃增菌10h，3對引物均能獲得擴增產物的檢測限達到3.8 cfu/10ml。
　　3，三種沙門氏菌血清型多重PCR檢測方法
　　以SEN1383、STM4494、SPC_0872和invA基因作為靶點，建立腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和沙門氏菌屬檢測的多重PCR檢測方法。當反應體系分別獲得141bp、534bp、212bp和284bp時，該檢測結果為陽性

12、。利用48株沙門氏菌和18株非沙門氏菌進行特異性驗證，結果表明，特異性達到100％。通過10h的增菌培養(yǎng)，該方法對以上三種血清型菌落靈敏度均小于10 cfu/ml。選取都柏林沙門氏菌、阿貢納沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌作為該檢測的干擾菌，用N×104cfu/ml-Nc fu/ml的干擾菌分別與102cfu/ml的沙門氏菌的目標血清型共同培養(yǎng)，進行PCR反應，結果表明在該檢測體系中能抵抗以上3種血清型對目標菌株檢測的干擾作用。人工污染實驗表明

13、，為了實現(xiàn)3個血清型的檢測限均小于10 cfu/10ml，需經過LB液體培養(yǎng)基37℃增菌12h。
　　4，海德爾堡沙門氏菌的real-time PCR檢測方法
　　以SeHA_C3258和invA基因為模板分別設計引物和探針(熒光信號分別為JOE和FAM)，建立海德爾堡沙門氏菌和沙門氏菌屬檢測的real-time PCR檢測方法。當同時檢測到兩個信號的擴增曲線時，該檢測結果為海德爾堡沙門氏菌陽性結果。通過48株沙門氏菌和18

14、株非沙門氏菌進行特異性驗證，結果表明，特異性達到100％。該real-time PCR對基因組的靈敏度為112.4fg/ul;對純菌增菌培養(yǎng)前和增菌培養(yǎng)后的靈敏度分別為2.4×104cfu/ml和2.4cfu/ml。該檢測方法在不同濃度模板情況下，變異系數(shù)在0.43-1.15％之間，表明該體系具有較好的重復性。在雞肉和豬肉背景菌群干擾作用下，該檢測方法的檢測限分別為2.54×103cfu/ml和1.7×102cfu/ml，說明該檢測方法

15、具有較好的抗干擾能力。而且，利用試劑盒法提取樣品中的DNA過程中可以去除樣品中Taq酶反應抑制劑，避免檢測出現(xiàn)假陰性結果。在人工污染雞肉和豬肉樣品中，經過LB液體培養(yǎng)基37℃增菌6h，該體系的檢測限能達到1 cfu/25g。
　　5，沙門氏菌及其丙型副傷寒沙門氏菌real-time NASBA檢測方法
　　以xcd基因的保守序列作為檢測靶點，建立沙門氏菌檢測的real-time NASBA方法。通過48株沙門氏菌和18株非沙

16、門氏菌進行特異性驗證，結果表明，所有沙門氏菌能獲得擴增曲線，非沙門氏菌無熒光信號被采集，特異性達到100％。當樣品中RNA模板的濃度高于10.5fg/ul時，該real-time NASBA可獲得有效的擴增曲線;通過10h增菌培養(yǎng)，該方法的菌落靈敏度為7×10-1 cfu/ml。該檢測方法針對不同血清型的模板及其在不同模板濃度情況下，標準偏差在0.613-2.203之間，表明該體系對沙門氏菌的檢測具有較好的重復性。提取樣品的總RNA經過

17、DNaseⅠ酶處理，仍能獲得擴增曲線;但是經過RNase H酶處理，無任何擴增，證明該反應是直接針對于RNA的擴增技術。而且，該方法在對熱處理24h后死菌的檢測與國標檢測的結果一致，均呈現(xiàn)陰性。該體系在4.75×107cfu/ml的豬肉背景菌群的干擾下，鼠傷寒沙門氏菌的檢測限能達到9.5×103 cfu/ml，說明該方法具有較好的抗干擾能力。人工污染實驗表明，經過LB培養(yǎng)基37℃增菌10h，在豬肉、牛肉和牛奶中的檢測限均小于10 cfu

18、/25g(ml)。
　　以SPC_0908和xcd基因作為模板設計引物和分子信標(JOE和FAM)，建立丙型副傷寒沙門氏菌和沙門氏菌檢測的real-time NASBA方法。通過48株沙門氏菌和18株非沙門氏菌進行特異性驗證，結果表明，特異性達到100％。當樣品中RNA模板的濃度高于40.94fg/ul時，該方法可獲得兩條擴增曲線;通過10h增菌培養(yǎng)，該方法的純菌菌落靈敏度和人工污染雞肉和豬肉的靈敏度均小于10cfu/ml。針對不