高定植肝癌細胞株中差異表達基因SLC38A4、GJA1在肝癌肝內轉移過程中的作用及機制研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)，作為肝癌惡性腫瘤的一類，是中國發(fā)生率高且危害極大的惡性腫瘤之一。研究表明，肝內轉移是肝癌的首要轉移位點，也是肝癌致死的首要原因。目前對肝癌細胞的肝內轉移過程雖有所了解，但是研究尚不深入，尚無有效治療靶點和藥物阻斷肝癌肝內轉移過程。因此需要進一步明確肝癌細胞肝內轉移過程中的關鍵分子及其作用機制。
　　除了自身抑癌或促癌基因的改變外，細胞與他們賴以生存的微環(huán)境

2、之間的相互作用對于正常組織內穩(wěn)態(tài)以及腫瘤組織的生長都是至關重要的。特別是腫瘤細胞與相關間質之間的相互作用形成了一個強大的關系網，可影響腫瘤的發(fā)生、進展和預后。腫瘤的轉移是一個復雜的、多步驟、多因素參與的過程，包括原發(fā)腫瘤的形成、原發(fā)灶腫瘤細胞的局部侵襲，腫瘤細胞內滲入血管和淋巴管，在血管和淋巴管中的生存，外滲出血管和淋巴管，在遠端定植灶的存活。腫瘤轉移過程中，腫瘤的微環(huán)境發(fā)揮了重要的作用，其中包括腫瘤低氧環(huán)境、腫瘤相關的巨噬細胞、T細胞

3、、NK細胞、樹突狀細胞、腫瘤相關的成纖維細胞以及內皮細胞等。任何腫瘤轉移的最終結局都是在遠端定植灶上形成新的腫瘤，腫瘤是如何在遠端定植灶的存活和再生這個問題一直是科學家想攻克的難題。為了研究腫瘤轉移過程的最終階段-在遠端定植灶的存活，篩選出能夠高定植的細胞顯得尤為重要。
　　為了研究肝癌轉移過程的最終階段-在遠端定植灶的存活，構建了脾臟注射-肝定植（轉移）模型，利用該模型篩選獲得了一系列的高定植（轉移）能力的肝癌細胞株。利用表達譜

4、芯片檢測，根據(jù)P值＜0.05，差異倍數(shù)≥5倍，篩選到64條在高定植細胞中差異表達的mRNA。進一步在更多的高定植細胞中驗證，以確保在除了芯片中的兩株細胞以外至少還有另外兩株高定植細胞表達符合差異基因的表達結果，以此篩選到31條基因，其中上調表達基因17條、下調表達基因14條。根據(jù)與肝癌臨床病人預后之間的關系，最終篩選到SLC38A4、GJA1在高定植細胞株中普遍存在差異表達，在多個隊列的肝癌組織樣本中也存在差異表達，并且與肝癌病人的高復

5、發(fā)率、差的預后相關。
　　發(fā)現(xiàn)SLC38A4不僅在肝癌組織樣本中下調表達并且隨著肝癌的進展表達量逐漸降低，在肝臟發(fā)育過程中還呈現(xiàn)逐漸上調表達的趨勢，且與肝癌病人的預后呈正相關，即肝癌病人SLC38A4含量越高，病人的預后情況越好。又對SLC38A4的臨床預后進行研究，發(fā)現(xiàn)SLC38A4的表達情況與肝癌病人的腫瘤大小、TNM分期、BCLC分期、腫瘤轉移以及血清AFP含量相關。隨后進行了SLC38A4的生物學功能研究，干性球形成實驗證

6、實干擾SLC38A4增強肝癌細胞的干性能力;CCK8、乙炔脫氧尿甘結合染色(EDU)細胞增殖實驗以及細胞周期檢測證實干擾SLC38A4促進肝癌細胞增殖;劃痕實驗以及transwell實驗證實干擾SLC38A4可以促進肝癌細胞的遷移、侵襲;裸鼠體內皮下荷瘤實驗證實干擾SLC38A4促進腫瘤的增殖。上述結果證明SLC38A4為抑癌基因，干擾SLC38A4在體內體外條件下都可以促進肝癌的進展。Western blot結果顯示干擾SLC38A4

7、可以增加ERK和AKT磷酸化水平，表明干擾SLC38A4可以使腫瘤中的MAPK信號通路及PI3K/AKT信號通路活化，促進肝癌的進展和轉移。
　　對GJA1進行了研究，發(fā)現(xiàn)GJA1在高定植細胞中普遍高表達，在多個隊列的肝癌組織中也是高表達，并且與肝癌病人的高復發(fā)率、差的預后呈正相關。裸鼠脾臟注射-肝定植體內實驗證實，GJA1能夠增強肝癌細胞的肝內定植能力。對過表達GJA1的細胞進行了體外功能學實驗，CCK8、克隆形成、EDU檢測細

8、胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞周期變化，transwell實驗以及細胞劃痕實驗檢測細胞遷移侵襲能力，發(fā)現(xiàn)過表達GJA1對細胞本身的增殖能力、遷移侵襲能力沒有統(tǒng)計學意義的影響。為了探究高定植肝癌細胞株高定植的原因，對高定植肝癌細胞株進行裸鼠皮下荷瘤，發(fā)現(xiàn)體內情況下高定植細胞株所形成的腫瘤增殖更快，有更強的血管形成能力。將過表達GJA1的細胞進行裸鼠皮下荷瘤，CD31、CD34染色顯示過表達GJA1細胞形成的皮下荷瘤有更高的血管密度。為了探

9、究GJA1對血管形成的影響，用過表達GJA1細胞及對照組細胞的條件培養(yǎng)基刺激臍靜脈內皮細胞(HUVEC)發(fā)現(xiàn)小管形成并無差異性改變。由于GJA1可以使兩種細胞之間形成縫隙連接(gap junction)，使其相互之間傳遞物質，猜測過表達GJA1的細胞可能和HUVEC通過直接接觸后形成縫隙連接促進小管的形成，于是將過表達GJA1及對照的肝癌細胞與HUVEC進行共培養(yǎng)，檢測到過表達GJA1細胞相對于對照細胞與HUVEC共培養(yǎng)后形成小管能力增