中空纖維離心超濾法在藥代動力學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、藥物進(jìn)入人體血液循環(huán)后會與其中的血漿蛋白發(fā)生不同程度的可逆性結(jié)合，而其中只有游離部分藥物才能穿過細(xì)胞膜而接觸相應(yīng)的受體，與藥理作用強度密切相關(guān)。藥物與血漿蛋白的結(jié)合在一定條件下可保持恒定，當(dāng)游離型藥物隨著轉(zhuǎn)運和消除而減少時，部分結(jié)合型藥物就會隨即釋放成游離藥物，使血漿和作用部位仍維持一定的藥物濃度；藥物與血漿蛋白的結(jié)合也具有飽和性，這是因為血漿蛋白的結(jié)合能力是有限的，而當(dāng)藥物濃度超過血漿蛋白的結(jié)合能力時，藥物與血漿蛋白的結(jié)合出現(xiàn)飽和，導(dǎo)

2、致游離部分藥物突然增多；此外，臨床上合并用藥的情況較為常見，此時由于血漿中藥物與藥物間的相互作用，也會導(dǎo)致藥物蛋白結(jié)合程度的改變，這主要是由于合用藥物競爭藥物-蛋白結(jié)合位點所致，并且合用藥物的種類越多，這種競爭作用將會越明顯。
　　血漿蛋白結(jié)合率是指血漿中的蛋白結(jié)合部分藥物所占總藥物量的百分率，用于表征藥物與血漿蛋白的結(jié)合程度。血漿蛋白結(jié)合率影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄，從而影響其作用強度和作用時間，是藥代動力學(xué)研究中的重要參

3、數(shù)之一。因此，藥物血漿蛋白結(jié)合率研究對于新藥研究開發(fā)和臨床上指導(dǎo)合理用藥都是具有重要意義的。
　　目前測定藥物血漿蛋白結(jié)合率多用平衡透析法和超濾法，其中平衡透析法操作繁瑣費時，一般需要控溫37℃且透析12h以上，且大量透析液的加入稀釋了血漿樣品，可能會破壞原有的藥物-蛋白結(jié)合平衡，使測定結(jié)果失真；而超濾法也是目前常用的蛋白結(jié)合率測定方法，該方法操作較平衡透析法簡便省時，然而離心完成后所得超濾液體積占待測血漿體積的比例較大，使待測血

4、漿的膠體滲透壓和蛋白濃度的升高，因此所得蛋白結(jié)合率結(jié)果可能是在偏離血漿真實生理環(huán)境的前提下獲得的，且商品化的超濾管價格昂貴，分析成本較高。
　　本課題采用一種微型的中空纖維離心超濾裝置(HFCF-UF)用于測定藥物的血漿蛋白結(jié)合率。該方法是以中空纖維超濾膜為分離介質(zhì)，在離心力的作用下使游離藥物自由通過中空纖維超濾膜，而藥物-蛋白復(fù)合物因分子量較大而被截留；重要的是在離心完成后，所得超濾液的體積占待測血漿比例較小，這對于血漿中的藥物

5、-蛋白結(jié)合平衡幾乎不會造成影響，因此可在血漿保持原有生理環(huán)境的前提下測定藥物的蛋白結(jié)合率；此外，簡易的實驗裝置也大大降低了分析成本，更易普及應(yīng)用。所建方法為藥物的血漿蛋白結(jié)合率測定，尤其是在合并用藥的情況下藥物蛋白結(jié)合率的測定提供一種實用、可靠的分析手段。
　　新型的碳青霉烯類抗生素比阿培南，屬于時間-依賴性抗生素，該藥物PK/PD的一個評價參數(shù)是AUC＞MIC(即MIC以上的AUC部分)。本文借助于HFCF-UF裝置對血漿樣品進(jìn)

6、行前處理，結(jié)合HPLC測定其血藥濃度并進(jìn)行藥代動力學(xué)研究。樣品前處理操作簡單快速，且較傳統(tǒng)的沉淀蛋白法大大提高了檢測靈敏度。所建方法較適用于碳青霉烯類抗生素比阿培南的血藥濃度測定以及藥代動力學(xué)研究。
　　第一部分：中空纖維離心超濾法測定藥物的血漿蛋白結(jié)合率
　　(一)中空纖維離心超濾法測定綠原酸的血漿蛋白結(jié)合率
　　目的：利用微型的中空纖維離心超濾裝置結(jié)合HPLC-UV法測定綠原酸的血漿蛋白結(jié)合率。
　　方法：取

7、0.5 mL血漿樣品置中空纖維離心超濾裝置中，在1.78×103g下離心10min，抽取中空纖維內(nèi)超濾液10μL直接進(jìn)行HPLC-UV分析，得到綠原酸的游離濃度；并結(jié)合傳統(tǒng)的沉淀蛋白法測定血漿中綠原酸的總濃度。
　　結(jié)果：所得超濾液中無大分子物質(zhì)，可直接進(jìn)樣測定；游離綠原酸在0.126～4.04μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9991)，方法的絕對回收率為96.4％，RSD＜2.0％。在低、中、高(0.505μg·mL-

8、1，2.02μg·mL-1，4.04μg·mL-1)三種濃度下，綠原酸的蛋白結(jié)合率分別為38.7％，34.7％，35.6％。
　　結(jié)論：所建方法簡便快速，重現(xiàn)性好，適用于藥物血漿蛋白結(jié)合率的測定。綠原酸與人血漿蛋白有中等程度結(jié)合，且不存在濃度依賴性。
　　(二)中空纖維離心超濾法研究慶大霉素對萬古霉素血漿蛋白結(jié)合率的影響
　　目的：利用中空纖維離心超濾法研究在體外條件下慶大霉素是否會影響萬古霉素的蛋白結(jié)合率。
　

9、　方法：采用中空纖維離心超濾法分離-HPLC法測定血漿中游離的萬古霉素，并結(jié)合傳統(tǒng)的沉淀蛋白法測定其總藥物濃度?？疾煸隗w外條件下，慶大霉素的加入前后萬古霉素的蛋白結(jié)合率，并用配對t檢驗分析萬古霉素的蛋白結(jié)合率是否存在顯著性差異。分析方法采用ZORBAX SB-C18(150mm×4.6 mm，5μm)，流動相為甲醇-50 mmol·L-1磷酸氫二鉀(加0.3％三乙胺，用磷酸調(diào)pH3.2)=20:80，流速1 mL·min-1，檢測波長2

10、36 nm，進(jìn)樣量10μL。
　　結(jié)果：在低、中、高(10μg·mL-1，40μg·mL-1，80μg·mL-1)三種濃度下，單用萬古霉素時的血漿蛋白結(jié)合率依次為55.2％，54.8％，53.6％；與慶大霉素合用時，萬古霉素的血漿蛋白結(jié)合率變?yōu)?0.9％，49.5％，49.7％；配對t檢驗結(jié)果顯示P＜0.001，即慶大霉素的加入前后，萬古霉素的血漿蛋白結(jié)合率有顯著性差異。
　　結(jié)論：與慶大霉素合用后，萬古霉素的血漿蛋白結(jié)合率

11、下降，游離濃度有升高趨勢。
　　第二部分中空纖維離心超濾法測定比阿培南的血藥濃度
　　目的：采用中空纖維離心超濾法分離血漿中的比阿培南，結(jié)合HPLC-UV測定其血藥濃度，并進(jìn)行藥代動力學(xué)研究。
　　方法：將比阿培南含藥血漿用1 mol·L-1穩(wěn)定劑MOPS以1:1稀釋，取450μL稀釋后的血漿置于中空離心超濾裝置中，在3.60×103g下離心10 min，抽取超濾液10μL可直接進(jìn)行HPLC-UV分析，即得比阿培南的血

12、藥濃度。12名健康志愿者(男女各半)分別單劑量靜脈滴注比阿培南(300mg和600mg)，用3P97藥動學(xué)軟件進(jìn)行房室模型判斷并計算藥動學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果：(1)血漿中比阿培南濃度在0.1～50μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度較傳統(tǒng)的沉淀蛋白法提高了20倍，在低、中、高濃度下的平均超濾回收率為99.7％，日內(nèi)和RSD均不大于5.0％。(2)比阿培南的體內(nèi)過程符合二房室模型，單劑量靜滴300mg和600mg后，Cmax(

13、μg·mL-1)分別為15.02和31.40，t1/2(h)分別為1.32±0.18和1.28±0.20，AUC0～∞(mg·h·L-1)分別為11.64±3.16和23.98±6.17，CLs(L·h-1)分別為24.6±3.18和22.0±4.12。
　　結(jié)論：所建方法較傳統(tǒng)的沉淀蛋白法大大提高了檢測靈敏度，且操作簡單快速，僅經(jīng)10 min簡單離心即可完成一次樣品前處理，該方法的建立可為血漿中比阿培南的血藥濃度測定以及藥代動力