豬成纖維細(xì)胞重編程和可溶性豬源SOX2-11R重組蛋白制備.pdf

1、體細(xì)胞核移植（somatic cells nuclear transfer,SCNT）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）和基因編輯等技術(shù)的突破與完善，為醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)和生物學(xué)基礎(chǔ)研究等帶來(lái)了新的曙光。作為一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，豬在解剖學(xué)、生理學(xué)等方面比小鼠更接近于人類，正逐漸成為人類異種移植和再生醫(yī)學(xué)研究中理想的生物學(xué)模型。自SCNT和iPSCs取得成功以來(lái)，它們?cè)谪i上均有較大發(fā)展，

2、但SCNT還存在效率低和克隆后代死亡率高等問(wèn)題，而豬iPSCs也存在基因整合等安全性問(wèn)題。其中，源頭細(xì)胞作為兩種重編程技術(shù)中的首個(gè)關(guān)鍵步驟，適宜的源頭細(xì)胞可能為解決重編程中效率和安全等關(guān)鍵問(wèn)題提供思路。
　　本研究首先建立了豬胚胎成纖維細(xì)胞系（porcine embryonic fibroblasts,PEFs）和成年豬耳源成纖維細(xì)胞系（adult porcineear fibroblasts,APEFs）；并以PEFs、APEF

3、s、仔豬脂肪干細(xì)胞系（adipose-derived stem cells,ADSCs）為供體細(xì)胞進(jìn)行SCNT，探討對(duì)重構(gòu)胚胎發(fā)育能力的影響；其次，利用多西環(huán)素（DOX）誘導(dǎo)的慢病毒系統(tǒng)將PEFs、APEFs和ADSCs重編程為iPSCs，并對(duì)各自的重編程效率進(jìn)行對(duì)比分析。旨在借助SCNT和iPSCs兩種經(jīng)典的細(xì)胞重編程方法，綜合考慮各因素，優(yōu)選出供體細(xì)胞及其重編程方案；最后，通過(guò)原核表達(dá)的方法制備具有穿透細(xì)胞膜功能的可溶性的EGFP-

4、11R和SOX2-11R重組蛋白，以期為制備其它重組蛋白和以蛋白誘導(dǎo)獲取無(wú)基因整合的iPSCs奠定基礎(chǔ)。具體試驗(yàn)及結(jié)果如下：
　　試驗(yàn)一成纖維細(xì)胞建系和SCNT—通過(guò)酶消化、倒置貼壁培養(yǎng)和尼龍網(wǎng)過(guò)濾等方法，本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了PEFs，APEFs和ADSCs三株細(xì)胞系。在取材方面，因APEFs來(lái)自成年公豬耳緣皮膚組織，取材方便、成本低，在動(dòng)物良種資源保護(hù)上具有很大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值；ADSCs取自于仔豬背部皮下組織，操作復(fù)雜；而PEFs

5、取自于健康懷孕母豬的胎兒，取材和操作繁瑣、成本高。在增殖和細(xì)胞狀態(tài)方面，發(fā)現(xiàn)增殖數(shù)率由高到低依次為ADSCs，PEFs和APEFs；ADSCs和PEFs折光性好、形態(tài)飽滿，APEFs狀態(tài)則略差。在作為供體細(xì)胞支持重構(gòu)胚發(fā)育方面，以囊胚率做為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)ADSCs和PEFs顯著高于APEFs（P<0.05）。在重構(gòu)胚質(zhì)量方面，以囊胚總細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)PEFs源重構(gòu)胚的質(zhì)量顯著優(yōu)于APEFs（P<0.05）。
　　試驗(yàn)二成纖維細(xì)胞與A

6、DSCs源豬iPSCs建系—通過(guò)DOX誘導(dǎo)的慢病毒系統(tǒng)，成功使三種細(xì)胞發(fā)生了重編程過(guò)程，且都能觀察到AP陽(yáng)性克隆。通過(guò)對(duì)接種細(xì)胞數(shù)和克隆總數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)豬ADSCs的重編程效率高于其它兩株成纖維細(xì)胞系，與SCNT結(jié)果一致。
　　在PEFs源iPSCs的建立過(guò)程中，先后觀察到兩類克隆，這證明重編程是一個(gè)逐漸緩慢的過(guò)程，持續(xù)的單克隆傳代可能有利于重編程程度的提高。PEFs源iPSCs表現(xiàn)為AP陽(yáng)性，且在體外培養(yǎng)時(shí)無(wú)需額外添加藥物D

7、OX；在mRNA水平上，外源性O(shè)CT4, SOX2, KLF4和C-MYC表達(dá)顯著高于源頭細(xì)胞，且內(nèi)源性O(shè)CT4, SOX2, KLF4和C-MYC也得到了激活，OCT4和SOX2表現(xiàn)尤為明顯。在蛋白水平上，該株iPSCs表達(dá)OCT4和NANOG蛋白。在分化潛能方面，體外能形成擬胚體，形成效率在3％左右。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)，外源性基因OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC已整合到細(xì)胞基因組。
　　試驗(yàn)三可溶性EGFP-11R和

8、SOX2-11R重組蛋白的制備—依次通過(guò)載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)條件摸索和純化、蛋白鑒定與轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞等步驟，在大腸桿菌提取物的上清中成功獲取且純化出了EGFP-11R和SOX2-11R重組蛋白，且驗(yàn)證其都具有穿透細(xì)胞膜能力。其中，可溶性EGFP-11R重組蛋白的最佳表達(dá)條件為37℃和0.5 mol/L IPTG誘導(dǎo)4h，而可溶性SOX2-11R重組蛋白的最佳表達(dá)條件為28℃和0.5 mol/L IPTG誘導(dǎo)4h。
　　綜上所述，本研究首

9、先建立了PEFs和APEFs細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)APEFs在取材、建細(xì)胞系成本、動(dòng)物福利和良種資源保護(hù)方面要優(yōu)于PEFs和ADSCs。然后，同ADSCs一起對(duì)三者的重構(gòu)胚胎發(fā)育能力進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在以囊胚率為指標(biāo)的重構(gòu)胚發(fā)育方面ADSCs和PEFs要優(yōu)于APEFs，在囊胚質(zhì)量方面，發(fā)現(xiàn)PEFs源囊胚的總細(xì)胞數(shù)要高于APEFs源囊胚。此外，利用iPSCs技術(shù)對(duì)三種細(xì)胞的重編程潛能進(jìn)行了再次檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ADSCs顯著高于PEFs和APEFs，而PEFs