奧拉帕利對單核細(xì)胞動脈粥樣硬化過程的影響及其與NLRP3炎癥小體活性的關(guān)系.pdf

1、背景和目的：NLRP3炎性小體的激活是動脈粥樣硬化的主要發(fā)病因素。巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)激活NLRP3炎性小體，并隨后分泌促炎介質(zhì)和泡沫細(xì)胞形成。Poly（ADP-核糖）聚合酶(PARP)是DNA損傷的分子傳感器，在許多真核細(xì)胞（包括單核/巨噬細(xì)胞）中存在豐富的PARP酶。有證據(jù)表明，PARP過度激活是致多種炎癥性疾病包括動脈粥樣硬化的有害因素。本研究旨在探討1）Ox-LDL是否激活THP-1單核/巨噬細(xì)胞中PA

2、RP酶的活化;2）新近FDA批準(zhǔn)的抗癌藥物奧拉帕利(Olaparib)通過抑制PARP是否減弱NLRP3炎性小體的活性和隨后的促炎細(xì)胞因子的分泌、泡沫細(xì)胞形成和細(xì)胞的黏附，3）奧拉帕利介導(dǎo)的NLRP3炎性小體的抑制是否涉及NLRP3炎性小體激活的啟動和激活的兩個信號步驟。
　　方法：1.本課題的絕大部分實(shí)驗(yàn)是用被大家廣泛應(yīng)用的人單核巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞。THP-1細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)于含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃

3、，5％CO2的條件下培養(yǎng)。THP-1細(xì)胞經(jīng)或不經(jīng)奧拉帕利、MCC950、Ox-LDL處理，而分為對照組、Olaparib組、MCC組、Ox-LDL組、Olaparib+Ox-LDL組、MCC+Ox-LDL組、Olaparib+MCC+Ox-LDL共七組。
　　2.免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)在本課題中被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測和半定量測定。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用來檢測在NLRP3炎性小體

4、激活后分至培養(yǎng)基中的白細(xì)胞介素IL-1β和IL-18的量。
　　4.油紅O梁料被用來評估泡沫細(xì)胞的形成。用福爾馬林溶液固定后，用新鮮制備的油紅O染料液對THP-1細(xì)胞進(jìn)行染色。染色后的THP-1細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，并對拍攝的圖像中的陽性泡沫細(xì)胞進(jìn)行定量評估。
　　5.細(xì)胞粘附試驗(yàn)被用來評價THP-1單核巨噬細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的粘附，這一體外實(shí)驗(yàn)與單核細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮是相似的，單核巨噬細(xì)胞遷移到動脈

5、粥樣硬化病變部位是動脈粥樣致病的早期步驟。
　　6.常用于鑒定蛋白質(zhì)相互作用共免疫沉淀(CO-IP)實(shí)驗(yàn)用于評估NF-κB活性的動態(tài)變化。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)需要特異性的抗體及A/G親和珠。
　　結(jié)果：1.氧化型低密度脂蛋白以劑量和時間依賴的方式增加NLRP3炎性小體組分(NLRP3、ASC、Caspase1)和裂解型的PARP-1的蛋白表達(dá)。
　　2.奧拉帕利通過抑制PARP而抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的裂解型PARP-1蛋

6、白表達(dá)，而不抑制總PARP-1蛋白的表達(dá)。奧拉帕利還降低了氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體各組分(NLRP3、ASC、Caspase1)的蛋白表達(dá)。與預(yù)期一致，MCC950降低氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的NLRP3炎性小體各組分的蛋白表達(dá)，但單獨(dú)的奧拉帕利或MCC950處理組與對照組相比，NLRP3活性的沒有改變。
　　3.氧化型低密度脂蛋白增加白細(xì)胞介素IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá);奧拉帕利降低氧化型低密度脂蛋白所介導(dǎo)

7、的IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)，但單獨(dú)奧拉帕利處理組與對照組相比，IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)沒有改變。ELISA檢測顯示，氧化型低密度脂蛋白對IL-1β和IL-18的分泌有明顯的促進(jìn)作用，而奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的IL-1β和IL-18的分泌，但單獨(dú)應(yīng)用奧拉帕利，與對照組相比，IL-1β和IL-18的分泌沒有改變。
　　4.奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的LOX-1和CD36清道夫受體的蛋白表

8、達(dá)，但單獨(dú)奧拉帕利處理組與對照組相比，清道夫受體的蛋白表達(dá)沒有改變。與之相應(yīng)，油紅O染色實(shí)驗(yàn)顯示奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的泡沫細(xì)胞的形成，而單獨(dú)的奧拉帕利或MCC950組與對照組相比，泡沫細(xì)胞的形成沒有改變。
　　5.奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的VCAM-1蛋白的表達(dá);而單獨(dú)的奧拉帕利或MCC950組與對照組相比，VCAM-1蛋白的表達(dá)沒有改變。與之相應(yīng)，細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示，奧拉帕利顯著降低了氧化型低密

9、度脂蛋白介導(dǎo)的單核細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞的粘附，而單獨(dú)的奧拉帕利或MCC950組與對照組相比，細(xì)胞與HUVEC細(xì)胞的粘附?jīng)]有改變。
　　6.流式細(xì)胞檢測顯示，氧化型低密度脂蛋白增加了THP-1細(xì)胞的線粒體活性氧的生成。奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的線粒體活性氧的增加。
　　7.氧化型低密度脂蛋白增加了IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表達(dá)，奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表達(dá)

10、;而單獨(dú)的奧拉帕利或MCC950組與對照組相比，IKK-α和磷酸化IκBα的蛋白表達(dá)沒有改變。靜息狀態(tài)下，抗IκBα的抗體沉淀p65和p50，p65可被抗p50和抗IκBα所沉淀。奧拉帕利顯著降低了氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的IκBα與p65和p50的共免疫沉淀率，而奧拉帕利和氧化型低密度脂蛋白的單獨(dú)或聯(lián)合處理不影響p65與p50的免疫共沉淀。
　　8.靜息狀態(tài)下，抗IκBα的抗體沉淀RelB和p52，Rel B也可被抗p52和抗Iκ

11、Bα所沉淀。奧拉帕利處理組(Olaparib+Ox-LDL)降低了IκBα與RelB和p52免疫共沉淀，而奧拉帕利和氧化型低密度脂蛋白的單獨(dú)或聯(lián)合處理不影響RelB和P52的免疫共沉淀。
　　結(jié)論：1.氧化型低密度脂蛋白增加NLRP3炎癥小體和PARP的活性，奧拉帕利通過抑制PARP而抑制氧化型低密度脂蛋白所介導(dǎo)的PARP和NLRP3炎癥小體的活性。
　　2.奧拉帕利對PARP的抑制作用而抑制氧化型低密度脂蛋白介導(dǎo)的IL-1