綿羊equatorin（赤道素）的cDNA克隆、原核表達、抗體制備及在頂體反應前后精子上的定位.pdf

1、哺乳動物的成功受精是動物的種族延續(xù)和基因進化的前提，精子與卵子的質膜粘附并融合是哺乳動物完成受精所必需的步驟。近年來，在很多學者利用現(xiàn)代分子生物學手段對精卵質膜粘附和融合過程進行的研究中發(fā)現(xiàn)，精卵融合是一個多分子多受體的協(xié)調下共同參與發(fā)生的過程?，F(xiàn)階段普遍認為精卵融合的起始部位為精子膜赤道區(qū)，而對equatorin的研究起始于應用MN9單克隆抗體對精子上該蛋白的識別，而且體外注射MN9抗體能顯著抑制精卵融合，初步猜想Eqtn為精卵融合相

2、關蛋白。但是Eqtn究竟以何種方式參與頂體并最終介導精卵融合尚未知。
　　本實驗以內(nèi)蒙古綿羊為實驗動物，首先根據(jù)GenBank中已公布的相關物種Eqtn基因序列信息，對比其CDs區(qū)尋找保守序列，設計該基因的特異性引物。提取綿羊睪丸組織總RNA，通過反轉錄獲得cDNA，以此為模板克隆Eqtn基因的cDNA，并測序。測序后，根據(jù)該cDNA的可參考序列，設計特異性引物克隆去掉信號肽后的基因片段(19aa-336aa)。將克隆得到的cDN

3、A片段插入原核表達載體pGEX-4T-1，構建原核表達質粒pGEX-Eqtn;將重組質粒PGEX-Eqtn轉化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在最優(yōu)的表達條件下，37℃，大量表達Eqtn蛋白4h;利用還原性谷光甘肽親和純化柱子過濾菌體表達產(chǎn)物的上清液，獲得純化的融合蛋白GST-Eqtn。將獲得的Eqtn純化蛋白濃縮后，與弗氏佐劑等量混合制成抗原乳劑，皮下多點注射昆明雄性小鼠，每10天進行一次加強免疫。35天后注射S180腹水

4、瘤細胞。當免疫小鼠的腹部明顯鼓起后，收集腹水與血清中的多克隆抗體，利用間接Elasa法檢測了抗體的效價。根據(jù)抗原與抗體的特異性的免疫反應，通過Western Bloting檢測了該抗體對純抗原蛋白GST-Eqtn以及綿羊睪丸組織蛋白的免疫特異性。經(jīng)過檢測合格的自制抗體即可用于之后的免疫組織化學檢測。最后用自制的多克隆抗體分別對綿羊睪丸組織切片和頂體反應前后綿羊的精子細胞切片進行免疫組織化學染色，通過顯色反應識別抗體anti-Eqtn與相