調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在母胎耐受中的作用機(jī)制及對H-Y皮膚移植影響的研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：探討妊娠濃度雌、孕激素對小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響及可能機(jī)制。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分為體內(nèi)部分和體外部分。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：建立去勢C57BL/6小鼠模型，兩周后分別予以皮下注射雌激素（E2）、孕激素（P4）、雌孕激素聯(lián)合及溶劑（生理鹽水）模擬重建妊娠濃度小鼠激素水平。維持兩周后，流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化檢測給藥后小鼠外周血、脾臟、腹腔淋巴結(jié)、胸腺中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）比例變化情況。并通過ELISA的方法檢

2、測外周血中TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子水平的變化。體外實(shí)驗(yàn)：通過CFSE標(biāo)記磁珠分選的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)細(xì)胞，外加E2和共刺激信號，觀察標(biāo)記的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是否發(fā)生增殖，并進(jìn)一步通過CFSE標(biāo)記法結(jié)合單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)來驗(yàn)證其調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能。
　　 結(jié)果：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：無論雌、雄小鼠，去勢后單獨(dú)的妊娠水平的E2即可明顯提高外周血、脾臟、腹腔淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4

3、+T細(xì)胞的比例(分別為6.13±1.32％；10.50±1.85％；7.63±1.68％)，與溶劑組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。但在胸腺中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例與溶劑組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與此同時，單獨(dú)的妊娠水平的P4相比于溶劑組，Treg比例有所升高，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而聯(lián)合應(yīng)用雌、孕激素對Treg的影響與單獨(dú)應(yīng)用E2的結(jié)果類似，兩者沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。相同干預(yù)藥物，Treg的

4、比例變化在雌雄兩組之間沒有差異（P＞0.05）。同樣的結(jié)果在免疫組化中得到驗(yàn)證。對于外周血中細(xì)胞因子的影響，在沒有外來抗原刺激的條件下是沒有多大影響的。
　　 體外實(shí)驗(yàn)：單獨(dú)的E2處理對于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并不能直接誘導(dǎo)CFSE標(biāo)記的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖（PI=1.01±0.01），單獨(dú)的TCR雙信號刺激也不能檢測到CFSE的增殖（PI=1.03±0.02），只有在E2的預(yù)處理聯(lián)合CD3/CD28的刺激下才能檢測到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞自身的增殖

5、（PI=1.15±0.03）。驗(yàn)證了E2對于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量上的促增殖作用之后，功能學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CD3/CD28的刺激能顯著促進(jìn)CD4+CD25-Na?ve T細(xì)胞的增殖（PI=1.56±0.03），在此基礎(chǔ)上按照反應(yīng)細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比為1:1，未經(jīng)E2處理組也能檢測到對刺激后增殖的抑制（PI=1.18±0.04），E2的預(yù)處理能進(jìn)一步增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能（PI=1.07±0.02），不僅與刺激組相比有差異（1.07±

6、0.02vs1.56±0.03，P<0.05），與未經(jīng)E2處理組同樣有差異（1.07±0.02vs1.18±0.04，P<0.05）。證明了E2不僅能通過促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖而擴(kuò)增，而且在功能上也能進(jìn)一步增強(qiáng)其對效應(yīng)T細(xì)胞活化后增殖的抑制效應(yīng)。
　　 結(jié)論：單獨(dú)應(yīng)用妊娠濃度E2可明顯提高小鼠外周血，脾臟，腹腔淋巴結(jié)CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，妊娠濃度的P4對外周Treg沒有影響，兩種激素對中樞淋巴器官的淋巴細(xì)胞

7、均沒有影響。這可能與小鼠T淋巴細(xì)胞中雌、孕激素的受體分布、功能及與性別遺傳沒有相關(guān)性有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不僅驗(yàn)證妊娠水平的E2通過改變調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的無反應(yīng)性，在聯(lián)合TCR信號下能促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞自身發(fā)生增殖，還能在功能上加強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用。無論是中樞還是外周的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例均沒有影響。妊娠水平的雌、孕激素對于血清中細(xì)胞因子免疫網(wǎng)絡(luò)是沒有太大的影響。
　　 第二部分：
　　 目的：探討妊娠中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫調(diào)

8、節(jié)作用是否具有抗原特異性。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)分體外部分和體內(nèi)部分。體外實(shí)驗(yàn)：以雌性CBA/J與雄性DBA/2J同籠構(gòu)建流產(chǎn)趨勢模型，從流產(chǎn)趨勢孕10天雌鼠脾臟分離的單個核細(xì)胞經(jīng)尼龍毛處理后作為效應(yīng)T細(xì)胞（Tef）；DBA雄鼠脾細(xì)胞經(jīng)MMC處理后作為APC；根據(jù)培養(yǎng)體系中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的來源分組：未孕CBA雌鼠來源的Treg為未孕組，正常妊娠（CBA/J×Balb/c）來源的Treg為正常妊娠組，無關(guān)正常妊娠（Balb

9、/c×C57BL/6）來源的Treg為正常妊娠無關(guān)對照組。按照Tef與Treg比分別為10:1，1:1，1:5構(gòu)建單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系，72小時后，流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記細(xì)胞的增殖指數(shù)（Proliferative Index，PI），ELISA檢測細(xì)胞因子水平。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建流產(chǎn)趨勢的妊娠模型，于妊娠第0-2天，過繼輸注來自正常妊娠組、未孕組、無關(guān)妊娠對照組的CD4+CD25+Treg，觀察Treg的過繼輸注對妊娠結(jié)局的

10、影響。按照Treg的來源不同分為：正常妊娠組、未孕組、無關(guān)妊娠對照組。
　　 結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)：在Tef與Treg比例為10:1的體系中，未孕組效應(yīng)性T細(xì)胞增殖明顯受到抑制。在1:1，1:5的體系中同樣均能檢測到明顯的抑制效應(yīng)，但這種抑制效應(yīng)沒有劑量依賴性。而分別來自于其他兩組正常妊娠小鼠的Treg也表現(xiàn)出相似的增殖抑制效應(yīng)，各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在Treg的干預(yù)后培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子水平的變化在Treg的干預(yù)后，IL-10的水平

11、明顯升高，并且這種水平的升高呈Treg劑量依賴性正相關(guān)。而IFN-γ的水平明顯減少，并且與Treg劑量呈負(fù)相關(guān)。
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：在外周血中，流產(chǎn)趨勢組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較未孕組明顯增高（6.59％vs3.55％，P<0.05）；正常妊娠組中外周血能檢測到更為顯著的Treg的升高，不僅與未孕組有差異（8.34％vs3.55％，P<0.05），與流產(chǎn)趨勢組亦有明顯差異（8.34％vs6

12、.59％，P<0.05）。同樣，在淋巴結(jié)（6.86％vs4.85；9.62％vs4.85％，P<0.05；9.62％vs6.86％，P<0.05）中也獲得相似結(jié)果。過繼輸注后，只有來自正常妊娠組小鼠的Treg的過繼輸注才能完全阻止流產(chǎn)的發(fā)生。而來自未孕組和無關(guān)對照組的Treg不能逆轉(zhuǎn)流產(chǎn)的發(fā)生。Treg過繼輸注不能改變體內(nèi)Th1型細(xì)胞因子水平，但是能顯著提升IL-10水平。
　　 結(jié)論：無論哪種來源的Treg都具有免疫調(diào)節(jié)的潛能

13、。在體外均能檢測到對Treg增殖的抑制效應(yīng)，但并沒有表現(xiàn)出抗原特異性的更為顯著抑制功能；Treg在體外可能是通過分泌高濃度的IL-10發(fā)揮抑制效應(yīng)。但在體內(nèi)正常的妊娠過程中產(chǎn)生的Treg在保護(hù)胚胎免受母體攻擊方面是具有抗原特異性的，只有之前接觸胎兒父系抗原的具有抗原特異性的Treg才能在體內(nèi)發(fā)揮對胎兒的保護(hù)作用。
　　 第三部分：
　　 目的：探討妊娠濃度雌激素(E2)、孕激素(P4)對小鼠H-Y皮膚移植的影響及其機(jī)制。

14、方法：建立小鼠去勢模型，每日分別注射E2、P4及E2+P4聯(lián)合注射，14d后受鼠行H-Y皮膚移植并繼續(xù)給藥。檢測移植前及移植后第3天外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）變化及外周血細(xì)胞因子水平；觀察H-Y皮膚移植物的存活。
　　 結(jié)果：E2可提高外周血Treg的比例（6.13±1.32％vs3.26±0.68％，P<0.05），移植后Treg的比例進(jìn)一步升高（11.78±2.32％vs3.33±0.57

15、％，P<0.05）；P4對Treg沒有顯著影響（4.01±0.79％vs3.26±0.68％，P>0.05），而移植前后E2+P4聯(lián)合對Treg的影響與單獨(dú)應(yīng)用E2結(jié)果相似（6.13±1.32％vs7.25±1.71％，P>0.05；12.35±3.04％vs11.78±2.32％，P>0.05）。移植后P4對Treg仍無明顯影響，而E2+P4聯(lián)合亦不能進(jìn)一步提高Treg的比例。細(xì)胞因子檢測顯示，E2、P4均能減少促炎因子分泌，并提高抗