環(huán)指蛋白2調節(jié)前列腺癌細胞周期和凋亡的表觀遺傳學機制研究.pdf

1、目的：組蛋白的翻譯后修飾是表觀遺傳調控的重要內容，已被證實在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演了重要的角色。環(huán)指蛋白2（ring finger protein2，RNF2）是多梳蛋白抑制性復合物1（polycomb repressive complex1，PRC1）的催化亞單位，可介導組蛋白H2A（histone2A，H2A）的單泛素化修飾。研究表明，RNF2在多種腫瘤中呈特異性高表達，且具有促腫瘤效應。但是RNF2在前列腺癌（prostate

2、 cancer，PCa）中的研究還鮮有報導。在本研究中，我們首先通過對PCa組織和良性前列腺增生組織（benign prostatic hyperplasia，BPH）中RNF2的表達進行檢測，以明確RNF2在PCa中的表達水平。隨后，通過在PCa細胞系中特異性下調RNF2的表達，檢測細胞周期、凋亡和細胞活力的變化，以明確RNF2在PCa中的生物學功能。進一步，我們通過尋找差異性表達基因，篩選、驗證受RNF2調控的下游靶基因并探索其相關

3、的分子機制。
　　方法：
　　1.利用免疫組織化學染色（immunohistochemistry，IHC）對含有PCa（n=81）和BPH（n=71）的組織芯片（tissue microarray，TMA）進行RNF2的染色并利用H-Score評分系統對RNF2的表達水平進行評分，對PCa組織和BPH組織中RNF2的表達進行差異性分析，并對PCa組織中RNF2的表達水平與腫瘤的Gleason評分進行相關性分析。
　　2

4、.設計并合成靶向RNF2的特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）（siRNF2＃1和siRNF2＃2）以及陰性對照siRNA（siNC）。將它們轉染DU145和LNCaP細胞并利用實時定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）和蛋白電泳（western blot，WB）對下調效果分別在mRNA水平和蛋白水平進行驗證。利用流式細胞術（flow cytometry

5、，FCM）對各處理組細胞的凋亡和細胞周期進行檢測。利用噻唑藍比色法（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide assay，MTT assay）檢測各處理組細胞的活力。
　　3.設計并合成靶向 RNF2的特異性短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）（shRNF2＃1和shRNF2＃2）及對照shRNA（shScr），構建

6、帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的shRNA慢病毒表達載體。將慢病毒包裝載體及shRNA表達載體共同轉染293T細胞進行慢病毒的包裝，所得慢病毒分別命名為shRNF2＃1、shRNF2＃2和shScr。所得慢病毒分別感染DU145和LNCaP細胞，熒光顯微鏡下觀察感染效率。利用RT-qPCR和WB檢測RNF2的下調效果，利用FCM和MTT檢測各處理組細胞的周期、凋亡和細胞活力變化。
　

7、　4.將shRNF2＃1、shRNF2＃2和shScr感染后的DU145細胞進行擴大培養(yǎng)，以5×106個細胞分別接種于裸鼠背外側近右側大腿處，觀察各處理組移植瘤的生長情況，繪制生長曲線。觀察結束后對所有實驗小鼠實施安樂死，對腫瘤組織進行固定、包埋和切片。利用IHC對各處理組腫瘤組織中增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3，

8、cleaved-casp3）進行染色，以評價細胞的增殖和凋亡情況。
　　5. siRNF2＃1、siRNF2＃2和siNC分別轉染DU145細胞，72小時后提取各處理組細胞總RNA并送上海伯豪生物技術公司進行數字基因表達譜檢測，尋找RNF2下調組細胞與正常對照組細胞的差異性表達基因，并利用GeneOntology、BioCarta-ATCG等在線數據庫對差異性表達基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）分析。利用RT-

9、qPCR和WB進行驗證，尋找RNF2的潛在功能性下游靶基因。對方法4中所得各處理組移植瘤組織進行RNF2和相應靶基因的IHC染色，驗證二者的相關性。
　　6.針對前期實驗篩選出的RNF2潛在下游靶基因硫氧還蛋白結合蛋白基因（thioredoxin interacting protein，TXNIP）設計合成特異性siRNA和shRNA，構建shRNA的慢病毒表達載體并進行慢病毒包裝，分別命名為siTXNIP和shTXNIP。利用s

10、iTXNIP和shTXNIP對RNF2下調細胞進行功能學挽救實驗。siRNA實驗分組為：siRNF2＃1、siTXNIP、siRNF2＃1+siTXNIP和siNC；shRNA實驗分組為：shRNF2＃1、shTXNIP、shRNF2＃1+shTXNIP和shScr。利用RT-qPCR和WB檢測各處理組細胞RNF2和TXNIP的表達水平，利用FCM和MTT檢測細胞的周期、凋亡和細胞活力的變化。
　　7.針對TXINP基因啟動子區(qū)設

11、計特異性PCR引物，利用染色質免疫共沉淀技術（chromatin immunoprecipitation，ChIP）檢測TXNIP啟動子區(qū)RNF2的富集和組蛋白H2AK119Ub的水平。利用siRNA特異性下調RNF2的表達后，檢測RNF2和H2AK119Ub在TXNIP啟動子區(qū)的富集和水平變化。
　　結果：
　　1.對TMA的IHC染色和H-Score評分結果顯示，PCa組織中RNF2的表達水平（H-Score：117.5

12、3±62.34）明顯高于BPH組織（H-Score：90.14±63.66）。PCa組織中，RNF2的表達水平與Gleason評分的相關性分析結果顯示，Gleason評分高（Gleason評分＞7）的PCa組織中RNF2的表達水平（H-Score：150.50±62.03）明顯高于Gleason評分低（Gleason評分≤6）的PCa組織（H-Score：97.10±53.63）。
　　2.RT-qPCR和WB結果顯示，siRNF

13、2＃1和siRNF2＃2均能在mRNA水平和蛋白水平有效下調RNF2的表達。FCM檢測結果顯示，與對照組細胞相對，RNF2下調組DU145和LNCaP的G1期細胞和凋亡細胞顯著增加。MTT結果提示，RNF2下調組細胞的活力較正常對照組顯著降低。
　　3.成功包裝能特異性下調RNF2的慢病毒顆粒并能有效感染目的細胞。RT-qPCR和WB結果顯示，shRNF2＃1和shRNF2＃2均能在mRNA水平和蛋白水平有效下調RNF2的表達。細

14、胞功能學實驗結果顯示，shRNF2＃1和shRNF2＃2可誘導DU145和LNCaP細胞的G1期阻滯、凋亡增加和細胞活力下降。
　　4.成功建立了shScr、shRNF2＃1和shRNF2＃2慢病毒感染后的DU145細胞裸鼠移植瘤模型。結果顯示，shScr、shRNF2＃1和shRNF2＃2處理組移植瘤在觀察終點的體積分別為846.80±55.29mm3、304.33±63.72mm3和331.93±84.42mm3。腫瘤生長曲線

15、結果顯示，實驗組移植瘤的生長速度顯著低于對照組。IHC染色結果顯示，與shScr處理組相比，shRNF2＃1和shRNF2＃2處理組腫瘤組織中PCNA的表達水平明顯降低，而cleaved-casp3的水平顯著增加。
　　5.對數字基因表達譜結果的分析顯示，特異性下調RNF2所導致的≥1.5倍的差異化表達基因達632個，其中144個基因表達上調。利用Gene Ontlogy和BioCarta-TCGA等數據庫的GO分析結果顯示，大量

16、差異性表達基因參與細胞周期、有絲分裂、增殖和凋亡等生物學行為的調控?；赑cGs的轉錄抑制功能考慮，我們重點對表達顯著上調的基因進行了分析、篩選并利用RT-qPCR和WB進行驗證。結果顯示，與細胞增殖、凋亡和周期調控密切相關的TXNIP是RNF2潛在的重要功能性下游靶基因。對DU145細胞裸鼠移植瘤組織的IHC染色結果顯示，RNF2下調組的腫瘤組織中TXNIP的表達水平顯著高于對照組腫瘤組織。
　　6.RT-qPCR和WB結果顯示

17、，siTXNIP和shTXNIP均能有效下調TXNIP的mRNA水平和蛋白水平。FCM結果顯示，通過siRNA或shRNA同時下調RNF2和TXNIP可有效挽救單獨下調RNF2所導致的DU145和LNCaP細胞凋亡增加和G1期阻滯。MTT實驗結果顯示，同時下調RNF2和TXNIP可有效挽救單獨下調RNF2所導致的DU145和LNCaP細胞活力降低。
　　7.ChIP實驗結果顯示，RNF2可直接結合于TXNIP的啟動子區(qū)并促進組蛋白

18、H2AK119的單泛素化。利用siRNA特異性下調RNF2的表達后，RNF2的富集和H2AK119Ub的水平均顯著降低。
　　結論：
　　1.RNF2在PCa中的表達水平顯著高于BPH，且其表達水平與腫瘤的Gleason評分呈正相關，RNF2在PCa的發(fā)生發(fā)展過程中具有促腫瘤效應。
　　2.RNF2對PCa細胞的周期、凋亡和細胞活力有重要的調控作用，下調RNF2可誘導PCa細胞發(fā)生周期阻滯，凋亡增加和細胞活力下降，并可