環(huán)指蛋白2調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞周期和凋亡的表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、目的：組蛋白的翻譯后修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要內(nèi)容，已被證實(shí)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演了重要的角色。環(huán)指蛋白2（ring finger protein2，RNF2）是多梳蛋白抑制性復(fù)合物1（polycomb repressive complex1，PRC1）的催化亞單位，可介導(dǎo)組蛋白H2A（histone2A，H2A）的單泛素化修飾。研究表明，RNF2在多種腫瘤中呈特異性高表達(dá)，且具有促腫瘤效應(yīng)。但是RNF2在前列腺癌（prostate

2、 cancer，PCa）中的研究還鮮有報(bào)導(dǎo)。在本研究中，我們首先通過(guò)對(duì)PCa組織和良性前列腺增生組織（benign prostatic hyperplasia，BPH）中RNF2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以明確RNF2在PCa中的表達(dá)水平。隨后，通過(guò)在PCa細(xì)胞系中特異性下調(diào)RNF2的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡和細(xì)胞活力的變化，以明確RNF2在PCa中的生物學(xué)功能。進(jìn)一步，我們通過(guò)尋找差異性表達(dá)基因，篩選、驗(yàn)證受RNF2調(diào)控的下游靶基因并探索其相關(guān)

3、的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.利用免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）對(duì)含有PCa（n=81）和BPH（n=71）的組織芯片（tissue microarray，TMA）進(jìn)行RNF2的染色并利用H-Score評(píng)分系統(tǒng)對(duì)RNF2的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)分，對(duì)PCa組織和BPH組織中RNF2的表達(dá)進(jìn)行差異性分析，并對(duì)PCa組織中RNF2的表達(dá)水平與腫瘤的Gleason評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2

4、.設(shè)計(jì)并合成靶向RNF2的特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）（siRNF2＃1和siRNF2＃2）以及陰性對(duì)照siRNA（siNC）。將它們轉(zhuǎn)染DU145和LNCaP細(xì)胞并利用實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）和蛋白電泳（western blot，WB）對(duì)下調(diào)效果分別在mRNA水平和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。利用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry

5、，F(xiàn)CM）對(duì)各處理組細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。利用噻唑藍(lán)比色法（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide assay，MTT assay）檢測(cè)各處理組細(xì)胞的活力。
　　3.設(shè)計(jì)并合成靶向 RNF2的特異性短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）（shRNF2＃1和shRNF2＃2）及對(duì)照shRNA（shScr），構(gòu)建

6、帶綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的shRNA慢病毒表達(dá)載體。將慢病毒包裝載體及shRNA表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝，所得慢病毒分別命名為shRNF2＃1、shRNF2＃2和shScr。所得慢病毒分別感染DU145和LNCaP細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察感染效率。利用RT-qPCR和WB檢測(cè)RNF2的下調(diào)效果，利用FCM和MTT檢測(cè)各處理組細(xì)胞的周期、凋亡和細(xì)胞活力變化。
　

7、　4.將shRNF2＃1、shRNF2＃2和shScr感染后的DU145細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以5×106個(gè)細(xì)胞分別接種于裸鼠背外側(cè)近右側(cè)大腿處，觀察各處理組移植瘤的生長(zhǎng)情況，繪制生長(zhǎng)曲線。觀察結(jié)束后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行固定、包埋和切片。利用IHC對(duì)各處理組腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3，

8、cleaved-casp3）進(jìn)行染色，以評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖和凋亡情況。
　　5. siRNF2＃1、siRNF2＃2和siNC分別轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，72小時(shí)后提取各處理組細(xì)胞總RNA并送上海伯豪生物技術(shù)公司進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜檢測(cè)，尋找RNF2下調(diào)組細(xì)胞與正常對(duì)照組細(xì)胞的差異性表達(dá)基因，并利用GeneOntology、BioCarta-ATCG等在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異性表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）分析。利用RT-

9、qPCR和WB進(jìn)行驗(yàn)證，尋找RNF2的潛在功能性下游靶基因。對(duì)方法4中所得各處理組移植瘤組織進(jìn)行RNF2和相應(yīng)靶基因的IHC染色，驗(yàn)證二者的相關(guān)性。
　　6.針對(duì)前期實(shí)驗(yàn)篩選出的RNF2潛在下游靶基因硫氧還蛋白結(jié)合蛋白基因（thioredoxin interacting protein，TXNIP）設(shè)計(jì)合成特異性siRNA和shRNA，構(gòu)建shRNA的慢病毒表達(dá)載體并進(jìn)行慢病毒包裝，分別命名為siTXNIP和shTXNIP。利用s

10、iTXNIP和shTXNIP對(duì)RNF2下調(diào)細(xì)胞進(jìn)行功能學(xué)挽救實(shí)驗(yàn)。siRNA實(shí)驗(yàn)分組為：siRNF2＃1、siTXNIP、siRNF2＃1+siTXNIP和siNC；shRNA實(shí)驗(yàn)分組為：shRNF2＃1、shTXNIP、shRNF2＃1+shTXNIP和shScr。利用RT-qPCR和WB檢測(cè)各處理組細(xì)胞RNF2和TXNIP的表達(dá)水平，利用FCM和MTT檢測(cè)細(xì)胞的周期、凋亡和細(xì)胞活力的變化。
　　7.針對(duì)TXINP基因啟動(dòng)子區(qū)設(shè)

11、計(jì)特異性PCR引物，利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation，ChIP）檢測(cè)TXNIP啟動(dòng)子區(qū)RNF2的富集和組蛋白H2AK119Ub的水平。利用siRNA特異性下調(diào)RNF2的表達(dá)后，檢測(cè)RNF2和H2AK119Ub在TXNIP啟動(dòng)子區(qū)的富集和水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)TMA的IHC染色和H-Score評(píng)分結(jié)果顯示，PCa組織中RNF2的表達(dá)水平（H-Score：117.5

12、3±62.34）明顯高于BPH組織（H-Score：90.14±63.66）。PCa組織中，RNF2的表達(dá)水平與Gleason評(píng)分的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Gleason評(píng)分高（Gleason評(píng)分＞7）的PCa組織中RNF2的表達(dá)水平（H-Score：150.50±62.03）明顯高于Gleason評(píng)分低（Gleason評(píng)分≤6）的PCa組織（H-Score：97.10±53.63）。
　　2.RT-qPCR和WB結(jié)果顯示，siRNF

13、2＃1和siRNF2＃2均能在mRNA水平和蛋白水平有效下調(diào)RNF2的表達(dá)。FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相對(duì)，RNF2下調(diào)組DU145和LNCaP的G1期細(xì)胞和凋亡細(xì)胞顯著增加。MTT結(jié)果提示，RNF2下調(diào)組細(xì)胞的活力較正常對(duì)照組顯著降低。
　　3.成功包裝能特異性下調(diào)RNF2的慢病毒顆粒并能有效感染目的細(xì)胞。RT-qPCR和WB結(jié)果顯示，shRNF2＃1和shRNF2＃2均能在mRNA水平和蛋白水平有效下調(diào)RNF2的表達(dá)。細(xì)

14、胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，shRNF2＃1和shRNF2＃2可誘導(dǎo)DU145和LNCaP細(xì)胞的G1期阻滯、凋亡增加和細(xì)胞活力下降。
　　4.成功建立了shScr、shRNF2＃1和shRNF2＃2慢病毒感染后的DU145細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。結(jié)果顯示，shScr、shRNF2＃1和shRNF2＃2處理組移植瘤在觀察終點(diǎn)的體積分別為846.80±55.29mm3、304.33±63.72mm3和331.93±84.42mm3。腫瘤生長(zhǎng)曲線

15、結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組移植瘤的生長(zhǎng)速度顯著低于對(duì)照組。IHC染色結(jié)果顯示，與shScr處理組相比，shRNF2＃1和shRNF2＃2處理組腫瘤組織中PCNA的表達(dá)水平明顯降低，而cleaved-casp3的水平顯著增加。
　　5.對(duì)數(shù)字基因表達(dá)譜結(jié)果的分析顯示，特異性下調(diào)RNF2所導(dǎo)致的≥1.5倍的差異化表達(dá)基因達(dá)632個(gè)，其中144個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。利用Gene Ontlogy和BioCarta-TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)的GO分析結(jié)果顯示，大量

16、差異性表達(dá)基因參與細(xì)胞周期、有絲分裂、增殖和凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)控?；赑cGs的轉(zhuǎn)錄抑制功能考慮，我們重點(diǎn)對(duì)表達(dá)顯著上調(diào)的基因進(jìn)行了分析、篩選并利用RT-qPCR和WB進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與細(xì)胞增殖、凋亡和周期調(diào)控密切相關(guān)的TXNIP是RNF2潛在的重要功能性下游靶基因。對(duì)DU145細(xì)胞裸鼠移植瘤組織的IHC染色結(jié)果顯示，RNF2下調(diào)組的腫瘤組織中TXNIP的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組腫瘤組織。
　　6.RT-qPCR和WB結(jié)果顯示

17、，siTXNIP和shTXNIP均能有效下調(diào)TXNIP的mRNA水平和蛋白水平。FCM結(jié)果顯示，通過(guò)siRNA或shRNA同時(shí)下調(diào)RNF2和TXNIP可有效挽救單獨(dú)下調(diào)RNF2所導(dǎo)致的DU145和LNCaP細(xì)胞凋亡增加和G1期阻滯。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同時(shí)下調(diào)RNF2和TXNIP可有效挽救單獨(dú)下調(diào)RNF2所導(dǎo)致的DU145和LNCaP細(xì)胞活力降低。
　　7.ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RNF2可直接結(jié)合于TXNIP的啟動(dòng)子區(qū)并促進(jìn)組蛋白

18、H2AK119的單泛素化。利用siRNA特異性下調(diào)RNF2的表達(dá)后，RNF2的富集和H2AK119Ub的水平均顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1.RNF2在PCa中的表達(dá)水平顯著高于BPH，且其表達(dá)水平與腫瘤的Gleason評(píng)分呈正相關(guān)，RNF2在PCa的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有促腫瘤效應(yīng)。
　　2.RNF2對(duì)PCa細(xì)胞的周期、凋亡和細(xì)胞活力有重要的調(diào)控作用，下調(diào)RNF2可誘導(dǎo)PCa細(xì)胞發(fā)生周期阻滯，凋亡增加和細(xì)胞活力下降，并可