長鏈非編碼RNA NR_024430在馬凡氏綜合征血管病變發(fā)生發(fā)展中的機制研究.pdf

1、馬凡氏綜合征(MFS)是由于編碼原纖維蛋白-1的基因突變而導(dǎo)致的一種常染色體顯性遺傳結(jié)締組織病，由此引發(fā)的主動脈瘤破裂是患者死亡的主要原因。現(xiàn)有的手術(shù)治療及藥物治療效果不甚理想，亟需在MFS發(fā)病機理的研究上產(chǎn)生突破，以期找到更為精準(zhǔn)有效的治療方法。主動脈中層的平滑肌細(xì)胞以及彈力纖維層是主動脈壁維持正常生理功能的基本單位，中層的平滑肌細(xì)胞的凋亡、功能失常以及彈力纖維的降解是MFS主動脈瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因。因此，研究導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞行為異常

2、以及彈力纖維層斷裂崩解的原因成為MFS升主動脈瘤發(fā)病機理的主要研究方向。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200nt的非蛋白編碼RNA，近年來的研究表明，lncRNA廣泛參與基因的表觀遺傳調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)以及miRNA的調(diào)控等生物學(xué)過程，且已有研究證實某些lncRNA在平滑肌行為的調(diào)控方面展現(xiàn)著重要的作用。而lncRNA在MFS血管病變中的研究尚未見相關(guān)報道，鑒于其在心血管發(fā)育以及平滑肌行為調(diào)控方面所展現(xiàn)出的多樣化

3、的調(diào)控機制，我們認(rèn)為在MFS血管病變的發(fā)生發(fā)展過程中，某些lncRNA起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。本課題利用人的組織樣本，通過芯片高通量篩選差異表達(dá)的mRNA和lncRNA，進一步運用生物信息學(xué)分析的方法找到與MFS升主動脈瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的lncRNA，重點研究其在調(diào)控主動脈平滑肌行為和重構(gòu)血管平滑肌細(xì)胞外基質(zhì)中的作用，找到一個導(dǎo)致MFS發(fā)生血管病變的關(guān)鍵信號通路，從而確定新的、特異、敏感的治療靶點，為實現(xiàn)MFS的精準(zhǔn)治療，改善MFS臨

4、床治療現(xiàn)狀提供堅實的理論基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容主要包含以下三個部分
　　第一部分 MFS升主動脈組織mRNA及l(fā)ncRNA表達(dá)譜檢測及相關(guān)的生物信息學(xué)分析
　　實驗組選取10例MFS患者，在外科手術(shù)時獲取升主動脈組織。對照組組織來源于冠狀動脈硬化患者，在接受搭橋手術(shù)主動脈壁打孔時獲取升主動脈組織。所有樣本均在離體后直接放入液氮中凍存。使用TRIZOL法提取總RNA，使用NanoDrop檢測總RNA的純度;利用變性瓊脂糖膠

5、，檢測總RNA的完整性，綜合運用上述方法挑選出總RNA質(zhì)量最優(yōu)的5組樣本，進行后續(xù)的高通量分析。使用Affymetrix最新高通量芯片HTA2.0(GeneChip Human Transcriptome Array2.0)，檢測兩組升主動脈組織中mRNA以及l(fā)ncRNA的表達(dá)情況，對所有芯片數(shù)據(jù)進行三維模型的主成分分析(3D-PCA)，判斷樣本間的離散水平，刪除離散度高的樣本，對剩余數(shù)據(jù)做更進一步的生物信息學(xué)分析。用Limma算法篩選

6、兩組之間的差異mRNA及l(fā)ncRNA，對差異表達(dá)的mRNA進行功能顯著性分析(GO-Analysis)，得到差異mRNA所顯著影響的功能;對差異mRNA進行信號通路的顯著性分析(Pathway-Analysis)，得到差異基因所參與的顯著性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;以顯著性GO為研究對象，基于GO的層次結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建功能關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(GO-Trees)，總結(jié)實驗影響的功能群體，以及顯著性功能間的內(nèi)在從屬關(guān)系;以顯著性Pathway中包含的差異基因為研究

7、對象，構(gòu)建基因間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(Gene-Act-Net)，從而得到差異基因構(gòu)成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)以及差異基因中位于中樞位置的核心調(diào)控基因;對顯著性Pathway中包含的差異基因和顯著性GO中包含的差異基因取交集，命名為交集mRNA;以交集mRNA和差異lncRNA為研究對象，通過基因自身的實測表達(dá)值構(gòu)建基因間的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(Co-expression-Network)，從網(wǎng)絡(luò)中確認(rèn)處于疾病關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)的lncRNA。運用熒光定量PCR

8、(qRT-PCR)驗證相關(guān)的lncRNA以及mRNA的表達(dá)。
　　在MFS升主動脈組織中，研究共篩選到顯著差異表達(dá)的602個mRNA以及376個lncRNA(Fold change＞1.5，P＜0.05)，功能顯著性分析(GO-Analysis)結(jié)果顯示，差異表達(dá)的mRNA主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)等相關(guān)的生物學(xué)進程;差異基因的信號通路生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，PPAR以及一些代謝相關(guān)的信號通路發(fā)生了顯著下調(diào)的改變，而ECM-

9、receptor interaction、proteindigestion and absorption、PI3K-AKT以及TGF-β等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則出現(xiàn)了顯著上調(diào)的改變。通過構(gòu)建相應(yīng)的mRNA-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及計算差異K-core值，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA NR024430極有可能在MFS血管病變的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用，且進一步的qRT-PCR驗證了lncRNA_024430在MFS升主動脈組織中的顯著下調(diào)。
　

10、　第二部分 lncRNA NR_024430在MFS血管病變發(fā)生發(fā)展中的作用和具體機制
　　該部分利用入主動脈原代平滑肌細(xì)胞(sciencell6110)對lncRNA NR_024430的功能及起作用的具體機制進行深入探討。利用RNA原位雜交技術(shù)(RNA-FASH)研究了lncRNA NR_024430在原代平滑肌細(xì)胞中的定位;運用反義核苷酸技術(shù)(antisense oligonucleotides，ASOs)，敲低原代平滑肌細(xì)

11、胞中的lncRNANR_024430，研究其在原代平滑肌中的功能;利用RNA測序技術(shù)（RNA-Seq），結(jié)合相關(guān)的生物信息分析方法，深入探討研究lncRNA NR_024430所影響的下游分子及生物學(xué)功能，并使用qRT-PCR技術(shù)驗證NR_024430所影響的下游的信號分子。利用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)結(jié)合高通量蛋白組學(xué)技術(shù)(HuProt2.0)，需找NR_024430所能調(diào)節(jié)的具體蛋白調(diào)節(jié)因子，深入探討其起作用的具體分子機制。研究進一步使用重組人

12、TGF-β1刺激人主動脈原代平滑肌細(xì)胞，探討NR_024430所參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與非經(jīng)典TGF-β信號通路之間的關(guān)系。
　　研究結(jié)果顯示，lncRNANR_024430表達(dá)定位于原代主動脈平滑肌的細(xì)胞核內(nèi)，RNA-Seq的結(jié)果顯示，敲低原代主動脈平滑肌細(xì)胞中的NR_024430，顯著增加到了平滑肌細(xì)胞的凋亡率（P＜0.05），且可以促進平滑肌細(xì)胞分泌相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，促進平滑肌細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-1、9(MMP-1、9)，

13、而這些改變均為MFS血管病變發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵生物學(xué)事件。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，NR_024430所參與的調(diào)節(jié)過程，獨立于非經(jīng)典的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且兩條通路互為補充，均在MFS主動脈瘤的進展中起重要的作用。蛋白組學(xué)的結(jié)果顯示與NR_024430相互結(jié)合蛋白大部分為轉(zhuǎn)錄因子，我們推測NR_024430的分子生物學(xué)功能很有可能與這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控息息相關(guān)。
　　第三部分 MFS中平滑肌狀態(tài)行為的改變
　　該部分使用MFS小鼠模

14、型FBN1 C1039G/+，結(jié)合HE染色及免疫熒光染色技術(shù)，觀察MFS小鼠升主動脈平滑肌細(xì)胞的形態(tài)改變;運用TUNEL技術(shù)，檢測MFS小鼠升主動脈平滑肌細(xì)胞凋亡情況;使用qRT-PCR技術(shù)，檢測人升主動脈組鈣相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的變化;利用Fluo-4標(biāo)記細(xì)胞胞漿鈣，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，檢測MFS小鼠升主動脈平滑肌細(xì)胞鈣庫鈣含量的變化。
　　研究結(jié)果顯示，MFS小鼠升主動脈平滑肌排列明顯異常，出現(xiàn)簇狀聚集現(xiàn)象，平滑肌細(xì)胞凋亡顯

15、著，且人MFS組織中ryr2的表達(dá)顯著下調(diào)，鈣庫檢測結(jié)果顯示MFS平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣庫鈣含量明顯多于正常對照。
　　結(jié)論:
　　1.lncRNANR_024430在MFS升主動脈組織中顯著下調(diào)。
　　2.NR_024430主要表達(dá)于原代主動脈平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核。
　　3.NR_024430參與了MFS主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　4.敲低NR_024430可以誘導(dǎo)原代主動脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　5.敲低N

16、R_024430可以促進原代主動脈平滑肌細(xì)胞分泌相關(guān)的炎性細(xì)胞因子。
　　6.敲低NR_024430可以促進原代主動脈平滑肌細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-1、9(MMP-1、9)，這些酶與主動脈中層彈力纖維的降解息息相關(guān)。
　　7.TGF-β1可以促進原代主動脈平滑肌細(xì)胞分泌MMP-2。
　　8.NR_024430所參與的調(diào)節(jié)過程，獨立于非經(jīng)典的TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且兩條通路互為補充，均在MFS主動脈瘤的進展中起重要的作