長鏈非編碼RNA-MALAT1在糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病變過程的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：探討長鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(long non codingRNA-metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1,lncRNA-MALAT1)在糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病變中的作用及其機(jī)制。
　　方法：⑴單次腹腔注射鏈脲霉素(Streptozocin，STZ)構(gòu)建大鼠糖尿病模型，RT-PCR檢測糖尿病大鼠、野生型大鼠的視網(wǎng)膜以及先天糖尿病小鼠、野生型小

2、鼠視網(wǎng)膜中MALAT1的表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用原位雜交技術(shù)檢測猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A)的MALAT1的表達(dá)情況。⑵野生型大鼠及糖尿病大鼠眼內(nèi)注射MALAT1 shRNA或Scr shRNA腺病毒，RT-PCR驗(yàn)證MALAT1的表達(dá)下調(diào)。采用視覺電生理(ERG)檢測MALAT1的下調(diào)對大鼠視覺功能的影響。采用TUNEL法檢測MALAT1下調(diào)對大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響。采用視網(wǎng)膜胰酶消化及糖原雪夫染色法檢測MALAT1下調(diào)對視網(wǎng)膜周

3、細(xì)胞缺失及無細(xì)胞血管形成的影響。采用伊凡氏藍(lán)-白蛋白染色法檢測MALAT1下調(diào)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管滲漏的影響。采用Western Blotting法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜中炎癥因子細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)情況，以探討MALAT1下調(diào)對糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)影響。⑶小RNA干擾的方法下調(diào)RF/6A細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)后，給予高糖（或H2O2）刺激，采用

4、MTT檢測RF/6A細(xì)胞的活力;采用Hoechst、JC-1、PI與臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞的凋亡或死亡情況，以探究MALAT1是否影響高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。VEGF或TNF-α誘導(dǎo)RF/6A細(xì)胞遷移和成管，采用細(xì)胞劃痕法及基質(zhì)毛細(xì)管發(fā)生實(shí)驗(yàn)分別檢測MALAT1下調(diào)對細(xì)胞遷移和成管能力的影響。⑷采用Western blotting法來檢測在高糖刺激和MALAT1下調(diào)處理后RF/6A細(xì)胞中p38、JNK及ERK1/2的激活情況，探究MALAT1是

5、否通過絲裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路調(diào)控視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的功能。
　　結(jié)果：①M(fèi)ALAT1在糖尿病大鼠和小鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)顯著上調(diào)。原位雜交結(jié)果顯示MALAT1在RF/6A細(xì)胞核內(nèi)大量表達(dá)。②RT-PCR結(jié)果顯示眼內(nèi)注射MALAT1 shRNA腺病毒的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中MALAT1表達(dá)水平下調(diào)，注射Scr shRNA腺病毒的沒有明顯改變。MALAT1表達(dá)下調(diào)后能

6、減輕糖尿病導(dǎo)致視功能下降及視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡;改善周細(xì)胞缺失、無細(xì)胞血管的形成及血管滲漏;減少視網(wǎng)膜中ICAM-1、VEGF和TNF-α等炎性因子的表達(dá)。③高糖或H2O2處理RF/6A細(xì)胞后，細(xì)胞活力下降，下調(diào)MALAT1后，活細(xì)胞的活力進(jìn)一步降低。VEGF或TNF-α處理后RF/6A細(xì)胞遷移與成管能力顯著增加，MALAT1的下調(diào)則降低細(xì)胞遷移與成管能力。④MALAT1下調(diào)導(dǎo)致p38磷酸化水平下降，但對ERK1/2或JNK1/2磷酸化水平