PI3K在P2Y受體調控的AC-cAMP-Epac-Kv通道信號通路中的作用及對胰島素分泌的影響.pdf

1、目的：
　　在胰島β細胞中，P2Y嘌呤受體(P2YR)的激活可以產(chǎn)生葡萄糖依賴性的促胰島素分泌作用，我們課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)P2YR調控的胰島素分泌是通過AC/cAMP/Epac/Kv通道信號途徑實現(xiàn)的，本實驗通過全細胞膜片鉗記錄技術和檢測胰島素分泌量的實驗來證明3-磷酸肌醇激酶(PI3K)參與了P2YR/AC/cAMP/Epac/Kv通道信號途徑，從而進一步完善了P2YR調控胰島素分泌的機制。
　　方法：
　　(1)

2、大鼠斷頭處死后，用75％的酒精消毒腹部皮膚，將腹部剖開，在膽管上剪個小口，向胰腺內注入已準備好的膠原酶P，然后將胰腺組織剝離下來，放入38℃恒溫水浴中讓其消化11分鐘后，終止消化，在1200轉每分鐘的條件下離心3分鐘，棄去上清，再加10ml的1077分離液，在3200轉每分鐘的條件下離心23分鐘，在體式鏡下挑取質量比較好的胰島(淡白色、透光率小、質感強、直徑在100-300um間)。將分離得到的胰島用DispaseⅡ消化成胰島細胞，所得

3、胰島和細胞一般可在一周內使用。
　　(2)分別用不同藥物干預胰島β細胞，用膜片鉗技術檢測各組藥物對胰島β細胞電壓依賴性鉀通道(Kv)的影響。
　　(3)將分得的胰島孵育24小時后，用放射性免疫分析法檢測其在不同藥物干預下胰島素分泌的情況。
　　結果：
　　(1)用Histopaque-1077梯度離心法分得的胰島，大小均勻，直徑在200μm左右，呈橢圓形或圓形，透光率小，有質感，大多數(shù)胰島包膜完整圓滑。用Disp

4、aseⅡ分離得到的胰島β細胞呈球形，表面光潔，在顯微鏡下可見胰島細胞呈單一或者幾個相連成團地分布在視野中。
　　(2)通過膜片鉗實驗得出,1μM蛋白激酶C(PKC)的抑制劑Ro31-8220、50μM Ras抑制劑FTS和20μM絲裂原激活的蛋白激酶(MEK)抑制劑PD98059都沒有阻斷P2Y受體激動劑ADP?S對Kv電流的抑制作用，在80mV時，記錄電流密度為Ro31-8220+ADPβS(n=7,117.04±4.61pA/

5、pF)、FTS+ADPβS(n=7,117.50±2.53pA/pF)和PD98059+ADPβS(n=7,112.58±3.36pA/pF)同ADPβS(n=7,111.35±2.39pA/pF)一樣，與對照組相比P<0.05。然而100 nM PI3K的抑制劑Wortmannin消除了ADPβS對Kv電流的抑制作用，在80mV時，記錄電流密度為Wortmannin+ADPβS(n=7,143.51±3.91pA/pF)較對照組(n=

6、7,145.24±2.51pA/pF) P>0.05。10μM鳥嘌呤核苷酸轉換因子(Epac)的激動劑8-pCPT-AM(CPT)也能抑制Kv電流，但Wortmannin可以阻斷CPT對Kv電流的抑制作用，在80mV時，記錄電流密度為CPT(n=7,111.36±4.96pA/pF)與對照組(n=7,145.31±3.21pA/pF)相比 P<0.01， CPT+Wortmannin(n=7,132.19±5.30pA/pF)與CPT(

7、n=7,111.36±4.96pA/pF)相比P<0.01。此外另一個PI3K的抑制劑BKM120在10μM濃度時也像Wortmannin一樣消除了Epac激動劑CPT對Kv電流的抑制作用。
　　(3)在胰島素分泌實驗中， PI3K的抑制劑Wortmannin和BKM120都抑制了ADP?S的促進胰島素分泌的作用，用放射性免疫分析法檢測每組胰島素的含量，將所測得結果都以2.8mM葡萄糖組(2.8G)進行標化后再進行比較得出，8.3

8、G(n=7,6.90±1.89)與2.8G(n=7,1±0.23)相比P<0.01；8.3G+ADPβS(n=7,15.79±1.74)與8.3G(n=7,6.90±1.89)相比 P<0.05；8.3G+wortmannin(n=7,6.74±2.08)與8.3G(n=7,6.90±1.89)相比P>0.05；wortmannin+ADP?S(n=7,8.97±1.80)較8.3G+ADPβS(n=7,15.79±1.74)P<0.0

9、5；8.3G+BKM120(n=7,8.09±1.93)與8.3G(n=7,6.90±1.89)相比P>0.05；BKM120+ADPβS(n=7,10.68±1.69)較8.3G+ADPβS(n=7,15.79±1.74) P<0.05。
　　結論：
　　(1)PKC的抑制劑Ro31-8220、Ras抑制劑FTS和MEK抑制劑PD98059都沒有阻斷P2Y受體激動劑ADPβS對Kv電流的抑制作用。
　　(2)PI3K

10、的抑制劑Wortmannin能阻斷P2Y受體激動劑ADPβS對Kv電流的抑制作用；同樣地Wortmannin和BKM120可以明顯地消除Epac的激動劑8-pCPT-AM對Kv電流的抑制作用。
　　(3)PI3K的抑制劑 Wortmannin和BKM120都消除了P2Y受體激動劑ADPβS的促進胰島素分泌的作用。
　　(4)PI3K是Epac和Kv通道之間的起關鍵作用的信號分子。
　　(5)P2Y受體對Kv通道的調節(jié)作