人原發(fā)性腦干損傷后腦干NOS和HIF-1的表達(dá)變化.pdf

1、原發(fā)性腦干損傷(primary brain stem injury,PBSI)通常是指暴力作用于頭部引起腦干為主的腦損傷,包括原發(fā)性腦干軸索損傷、挫裂傷和出血等,傷后可立即導(dǎo)致死亡或持續(xù)時間較長的昏迷,是顱腦損傷最重要的損傷和最易于引起死亡的因為之一。由于腦干損傷后死亡率較高、死亡者傷后存活時間短,常規(guī)病理學(xué)難以觀察到有形態(tài)學(xué)變化,但可能會在分子水平有顯著性改變,為此需要從分子水平研究腦干損傷。因此,尋找穩(wěn)定、可靠的分子指標(biāo)及檢測方法對

2、PBSI的診斷以明確死亡因為成為法醫(yī)病理學(xué)一個亟需解決的問題。
　　 有研究表明,一氧化氮(NO)在腦缺血性腦組織損害中發(fā)揮著重要作用,一氧化氮合酶(NOS)是NO合成過程中必需的酶,催化左旋L-精氨酸合成內(nèi)源性的NO。NOS有三種亞型:內(nèi)皮細(xì)胞型 NOS(eNOS),主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞；神經(jīng)元型NOS(nNOS),主要分布于神經(jīng)細(xì)胞；誘導(dǎo)型 NOS(iNOS),主要存在于巨噬細(xì)胞；其中 eNOS和 nNOS又合稱結(jié)構(gòu)型 N

3、OS(cNOS)。應(yīng)用非特異性的NOS受體阻斷劑左硝基精氨酸甲酯阻斷頸動脈結(jié)扎大鼠,結(jié)果既可能縮小腦缺血灶的梗死區(qū)也可能加重腦缺血的損傷,提示NOS的三種亞型對組織具有不同的效應(yīng)。目前已知在哺乳動物細(xì)胞中廣泛存在一個O2敏感的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),調(diào)節(jié)缺氧狀況下涉及的一系列特定基因的表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-induciblefactor1,HIF1)作為缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子能夠廣泛激活缺氧相關(guān)生理反應(yīng)的眾多基因如VEGF等,

4、精確調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中的氧氣濃度。腦干損傷必然會導(dǎo)致供氧降低,腦干缺氧后會刺激側(cè)枝循環(huán)形成以代償組織的需要。缺血缺氧能引起HIF1基因表達(dá)上調(diào)。目前對HIF在腦干損傷中的表達(dá)變化規(guī)律研究較少,而將它應(yīng)用于法醫(yī)死因鑒定更鮮有報道。
　　 目的：
　　 觀察原發(fā)性腦干損傷死亡者腦干內(nèi)NOS、HIF的表達(dá)變化,為原發(fā)性腦干損傷致死的病理學(xué)診斷、法醫(yī)學(xué)死因推斷提供穩(wěn)定、簡便、可行的檢測指標(biāo)及方法。
　　 方法與結(jié)果：

5、　　 1.研究對象
　　 人體腦干檢材為廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所2006年-2009年收集的尸體解剖檢案,從中篩選出死亡后48小時內(nèi)解剖的、符合實驗要求的腦干標(biāo)本30例,男27例,女3例,年齡3—75歲。傷后存活時間:5分鐘-72小時。對照組選取5例非顱腦損傷所致急性死亡案例。按傷后存活時間長短,將腦干損傷組分為6組:1h內(nèi)組、1-6h組、6-12h組、12-24h組、24-48h組、48-72h組,每組5例。
　　

6、2.實驗方法與結(jié)果
　　 2.1 HE染色采用水平面切法,循腦干易損的雙側(cè)顱神經(jīng)根部及重要神經(jīng)核團(tuán)為準(zhǔn),前自腦干腹側(cè),后至腦干背側(cè)止,作4塊水平面切塊。標(biāo)本 HE染色光鏡下觀察,見有:腦干周邊淺表部和腦干內(nèi)部出血,部分出血灶周圍見神經(jīng)細(xì)胞腫脹、或細(xì)胞漿嗜酸性增強(qiáng),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體減少甚至消失、細(xì)胞核皺縮,核質(zhì)聚集深染；顱神經(jīng)的根部及其周圍腦組織出血；膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,胞漿嗜酸性增強(qiáng)；存活時間較長者可見局灶性軟化灶形成、神經(jīng)纖維腫

7、脹、排列紊亂。
　　 2.2比色法檢測腦干神經(jīng)元內(nèi)總 NOS、iNOS、cNOS活性
　　 選取對照組、1h內(nèi)組、48—72h組為實驗對象,每組5例。嚴(yán)格按照NOS測定試劑盒(分型)的操作步驟進(jìn)行。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比,1h死亡組腦干的NOS和cNOS均升高,iNOS無顯著性變化；48-72h組NOS和 iNOS升高,cNOS無顯著性差異。(cNOS=NOS-iNOS)
　　 2.3免疫組化檢測

8、腦干神經(jīng)元 nNOS和 HIF的改變
　　 2.3.1 nNOS
　　 正常對照組腦干僅見少量nNOS陽性神經(jīng)細(xì)胞,1h死亡組可見大量陽性細(xì)胞分布,與對照組比較有顯著性差異,且隨時間增加陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)增多,表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)；24h到達(dá)高峰,隨后表達(dá)減弱。
　　 2.3.2 HIF—1α
　　 對照組神經(jīng)細(xì)胞偶見 HIF-1α表達(dá),傷后1h死亡組可見表達(dá) HIF—1α的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)增多,表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng),差異有統(tǒng)計學(xué)