三株乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶酶學(xué)性質(zhì)分析及轉(zhuǎn)化菜油腳生成共軛亞油酸活力比較和工藝條件的研究.pdf

1、共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是一組具有共軛雙鍵(—C=C—C=C—)的十八碳二烯酸位置與幾何異構(gòu)體混合物的總稱。一般認(rèn)為CLA因其雙鍵的位置及構(gòu)型共有16種同分異構(gòu)體，但在這十幾種同分異構(gòu)體中，只有c9,t11-CLA和 t10,c12-CLA兩種具有生理活性，且與人體及動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)密切相關(guān)。CLA作為一種新型的營(yíng)養(yǎng)保健品，除了具有很強(qiáng)的抗癌功能外，還具有抑制脂肪沉積、降低膽固醇、防止動(dòng)脈硬化、改善

2、人體代謝、調(diào)節(jié)血糖、防治糖尿病、增強(qiáng)免疫力、提高骨骼密度、抗氧化、改善睡眠等作用。
　　CLA的天然來(lái)源十分有限，生物法合成 CLA是利用微生物亞油酸異構(gòu)酶（Linoleicacid isomerase，LAI）的作用，轉(zhuǎn)化亞油酸（Linoleic acid，LA）或其衍生物生成CLA的技術(shù)，其底物多采用亞油酸、蓖麻油、葵花籽油、玉米胚芽油等一些昂貴的材料，合成成本較高。我國(guó)是油菜種植大國(guó)，每年菜油的產(chǎn)量多達(dá)1000萬(wàn)噸，菜油腳料

3、是提取菜油過(guò)程中菜籽油水化脫磷脂的廢棄物。按油腳量為菜油的1.5％左右估算，我國(guó)每年約有15萬(wàn)噸的菜油腳料產(chǎn)生。菜油腳料殘存油脂中含有的亞油酸完全可以在亞油酸異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)化生成極具生理活性的功能性脂肪酸—共軛亞油酸。該技術(shù)的應(yīng)用，將首先解決化學(xué)法高溫、高壓條件下毒副產(chǎn)物的形成問(wèn)題，提高CLA的產(chǎn)品質(zhì)量；其次解決傳統(tǒng)生物合成法轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高、污染大等諸多問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)高效率、高品質(zhì)、低消耗、無(wú)污染生產(chǎn)，滿足市場(chǎng)對(duì)CLA日益增

4、長(zhǎng)的需求，同時(shí)為農(nóng)業(yè)廢棄物—菜油腳料的研究開發(fā)提供有力的依據(jù)。
　　本文首先對(duì)嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854、植物乳桿菌CGMCC1.557和本實(shí)驗(yàn)室從泡菜中篩選得到的植物乳桿菌3-9的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了摸索，通過(guò)在其 MRS培養(yǎng)基中添加不同濃度的LA誘導(dǎo)物誘導(dǎo)其產(chǎn)生亞油酸異構(gòu)酶，發(fā)現(xiàn)這三株菌體對(duì)這種誘導(dǎo)物的敏感程度有所不同。當(dāng)添加的LA濃度為0.1mg/mL時(shí)，植物乳桿菌CGMCC1.557和植物乳桿菌3-9誘導(dǎo)產(chǎn)生的亞油酸異構(gòu)酶

5、活性最強(qiáng)；當(dāng)添加的LA濃度為0.3mg/mL時(shí)，嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854誘導(dǎo)產(chǎn)生的亞油酸異構(gòu)酶活性最強(qiáng)，由此確定了每種菌產(chǎn)酶培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)物的最佳添加量。
　　隨后利用硫酸銨分級(jí)沉淀確定了嗜酸乳桿菌 CGMCC1.1854、植物乳桿菌CGMCC1.557和植物乳桿菌3-9亞油酸異構(gòu)酶的最佳硫酸銨飽和度范圍，其中嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854 LAI的硫酸銨飽和度下限為30%，上限為80%，植物乳桿菌CGMCC1.557和植物

6、乳桿菌3-9 LAI的硫酸銨飽和度下限為40%，上限為80%。然后通過(guò)透析除鹽、聚乙二醇濃縮、凝膠過(guò)濾層析得到了電泳純的亞油酸異構(gòu)酶，實(shí)現(xiàn)了對(duì)這三種菌亞油酸異構(gòu)酶的分離純化。
　　接著比較了這三種乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、酶的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其中嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854亞油酸異構(gòu)酶的最適溫度為30℃，植物乳桿菌CGMCC1.557和植物乳桿菌3-9亞油酸異構(gòu)酶的最適溫度均為45℃

7、；三者亞油酸異構(gòu)酶的最適反應(yīng)pH均為6.5；嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854亞油酸異構(gòu)酶受溫度影響較為顯著，此酶不耐熱，而植物乳桿菌CGMCC1.557和植物乳桿菌3-9在低溫下酶活保持相對(duì)穩(wěn)定，在高溫下前者穩(wěn)定性不如后者；嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854亞油酸異構(gòu)酶受pH的影響較為顯著，其酸堿穩(wěn)定性最差，植物乳桿菌 CGMCC1.557亞油酸異構(gòu)酶在pH3.0～6.0之間基本保持穩(wěn)定，pH高于6.0時(shí)，穩(wěn)定性變差，植物乳桿菌3-9的亞

8、油酸異構(gòu)酶能適應(yīng)較寬的pH范圍，其酸堿穩(wěn)定性最優(yōu)；同時(shí)還確定了這三株乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854亞油酸異構(gòu)酶的Km值為18.99mmoL·L-1，Vmax為1.58ug·mL-1·min-1；植物乳桿菌1.557亞油酸異構(gòu)酶的Km值為14.83 mmoL·L-1，Vmax為1.75 ug·mL-1·min-1；植物乳桿菌3-9亞油酸異構(gòu)酶的Km值為14.26 mmoL·L-1，Vmax為1.94 ug

9、·mL-1·min-1。
　　通過(guò)比較嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854、植物乳桿菌CGMCC1.557和植物乳桿菌3-9的亞油酸異構(gòu)酶在各自最適pH和最適反應(yīng)溫度下轉(zhuǎn)化亞油酸生成共軛亞油酸能力的大小，確定了植物乳桿菌3-9的亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，轉(zhuǎn)化生成的共軛亞油酸是植物乳桿菌 CGMCC1.557的1.17倍，是嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854的1.72倍。然后比較了嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854、植物乳桿菌CGMCC1.

10、557和植物乳桿菌3-9的亞油酸異構(gòu)酶在各自最適pH和最適反應(yīng)溫度下轉(zhuǎn)化菜油腳料生成共軛亞油酸能力的大小，確定了植物乳桿菌3-9的亞油酸異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，轉(zhuǎn)化生成的共軛亞油酸是植物乳桿菌CGMCC1.557的1.03倍，是嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854的1.19倍。綜合以上結(jié)論，選擇植物乳桿菌3-9的亞油酸異構(gòu)酶為轉(zhuǎn)化菜油腳料生成共軛亞油酸的酶類。
　　通過(guò)一系列單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了植物乳桿菌3-9酶促菜油腳料生成共軛亞油酸的最

11、佳底物添加量、緩沖液種類、振蕩速度、轉(zhuǎn)化時(shí)間，然后設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定了最佳反應(yīng)條件：底物添加量為3.0mL、緩沖液為磷酸鉀緩沖液、振蕩速度為100r/min、轉(zhuǎn)化時(shí)間為18h，此時(shí)酶促菜油腳料生成共軛亞油酸的產(chǎn)量為244.85±4.91ug/mL，是優(yōu)化前的1.31倍。
　　最后通過(guò)研究輔酶因子、金屬離子、螯合劑對(duì)酶促反應(yīng)的影響，確定了輔酶因子ATP、ADP、NADH以及金屬離子Ca2+、Mg2+對(duì)酶的催化活性有一定