基于液體發(fā)酵的高三萜靈芝菌生物轉(zhuǎn)化大豆異黃酮及其抑制腫瘤活性研究.pdf

1、靈芝Ganoderma lucidum[(Leyss.ex.Fr.) Karst]是一種珍貴的藥用真菌，其作為藥物在我國(guó)已有2000多年的歷史，本文以高產(chǎn)三萜靈芝菌株為研究對(duì)象，研究?jī)?nèi)容包括:靈芝酸成分的初步鑒定，靈芝轉(zhuǎn)化大豆異黃酮及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抗癌活性和機(jī)理。
　　對(duì)5株供試靈芝菌株進(jìn)行菌株篩選得到最優(yōu)菌株為美國(guó)靈芝，其菌絲生物量、胞內(nèi)三萜、胞內(nèi)多糖、胞外多糖、和胞外三萜產(chǎn)量分別可達(dá)1.22±0.03g/100ml，39.29±

2、0.25mg/100ml,23.44±0.76 mg/100ml,11.50±0.74mg/ml,14.24±0.55 mg/ml;對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，基于ITS序列分析，該菌株鑒定為赤芝（G.lucidum），是可以用于保健食品的靈芝菌種，具備食用安全性;進(jìn)而對(duì)美國(guó)靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，靈芝菌絲接種到種子液中生長(zhǎng)8d后，按接種量10％(v/v)接種于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基(麥芽汁4.10％，酵母浸出粉1.8％，KH

3、2PO40.3％, MgSO40.15％, VB10.005％, pH5.40)，于180rpm,28℃，培養(yǎng)7d，可使靈芝菌絲生物量和胞內(nèi)三萜產(chǎn)量達(dá)到最高。此外，本文按照EuropeanBrewery Cenvention(EBC)方法制備麥芽汁，將其應(yīng)用于靈芝液體發(fā)酵以提高靈芝三萜產(chǎn)量，至今未見報(bào)道。
　　經(jīng)HPLC-ESI-MS初步鑒定，結(jié)果顯示靈芝菌絲中含有的10種靈芝酸為:Ganolucidic acid A, Gano

4、deric acid A, Ganoderenic acid B, Elfvingic acid A,Ganoderic acid F,7,15-dihydroxy-4,4,14-trimethyl-3,11-dioxochol-8-en-24-oic acid,Lucidenic acid C,3β-hydroxy-4,4,14-trimethyl-7,11,15-trioxochol-8-en-24-oic acid,Ganoder

5、ic acid H,3,7,15-trihydroxy-4,4,14-trimethyl-11-oxo-chol-8-en-24-oic acid。此外，靈芝在液體發(fā)酵過程中可以有效的富集氨基酸，尤其是人體必需氨基酸，同時(shí)還可富集微量元素，但對(duì)各元素的富集能力各有不同。
　　將含有菌絲體的靈芝發(fā)酵液勻漿，以β-葡萄糖苷酶酶活為1.0U/ml的靈芝勻漿液100ml(pH=5)作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)液，加入5g大豆異黃酮粗提物，于60℃下轉(zhuǎn)化4

6、8h，得到大豆苷元及染料木素轉(zhuǎn)化率分別為96.63％，87.82％。利用富集了生物活性物質(zhì)的靈芝勻漿液轉(zhuǎn)化大豆異黃酮至今尚未見報(bào)道。測(cè)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抗氧化能力，隨著底物濃度(0.5-10mg/ml)增加，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(TSI)、轉(zhuǎn)化前(SI)溶液各抗氧化指標(biāo)均隨之上升，并且在相同底物濃度下，TSI溶液抑制羥自由基能力（底物濃度＜6mg/ml）、DPPH清除能力、SOD酶活及T-AOC均高于SI溶液。
　　分別經(jīng)30％、50％、75％(v/

7、v)乙醇浸提靈芝轉(zhuǎn)化大豆異黃酮產(chǎn)物得到TSI-1、TSI-2、TSI-3提取液。經(jīng)MTT法檢測(cè)， TSI-1（120μg/ml），TSI-2(100μg/ml)，TSI-3(60μg/ml)對(duì)細(xì)胞HTL9，MCF-7，HepG2的增殖均有顯著的抑制作用，且都可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中，TSI-2(100μg/ml)對(duì)細(xì)胞HTL9凋亡影響最為顯著，晚凋細(xì)胞由8.27％增至40.13％，早凋細(xì)胞由0.95％增至9.05％。此外，經(jīng)TSI-2（1

8、00μg/ml）處理后，細(xì)胞HTL9、MCF-7被阻滯于G1期，HepG2被阻滯在S期，無法進(jìn)行分裂而誘導(dǎo)凋亡。
　　細(xì)胞HTL9經(jīng)TSI(100μg/ml)處理后，細(xì)胞中Bax相對(duì)含量增加，Bcl-2/Bax比值下降，同時(shí)Cyto-C蛋白表達(dá)含量顯著增加，激活Caspase-3，Caspase-8使其含量增加，由此可說明TSI主要是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。此外，抗凋亡因子Survivin相對(duì)表達(dá)量、NF-κB蛋白含量顯著降