酶法交聯(lián)結(jié)合熱處理對青蟹精氨酸激酶致敏性的影響.pdf

1、蟹類作為一種營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)鮮美的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品，廣受大家喜歡，隨之而來引發(fā)的食物過敏病例也是逐年增多，嚴重的影響了人們的生活質(zhì)量，因此對過敏原的消減已經(jīng)成為熱門研究方向。酶法交聯(lián)因為可以改善蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)，被廣泛應用于食品加工中，近期有研究表明其對過敏原致敏性也有一定的影響，但對甲殼類過敏原致敏性的影響并無報道。本文以精氨酸激酶（ariginine kinase, AK）為試驗對象，研究酶法交聯(lián)結(jié)合熱處理對AK致敏性的影響，并深入探究其

2、交聯(lián)位點，闡明致敏性改變的原因，為開發(fā)低致敏性產(chǎn)品提供理論依據(jù)。
　　本研究首先從擬穴青蟹中純化得到天然 AK，從大腸桿菌體外表達獲得重組 AK（recombinant ariginine kinase, rAK），對兩者的差異進行分析，結(jié)果顯示，rAK與AK在消化穩(wěn)定性和免疫結(jié)合活性方面沒有差別；在結(jié)構(gòu)方面，rAK游離巰基含量和疏水性高于AK，蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)折疊松散，導致其熱穩(wěn)定性下降。
　　為了研究酶法交聯(lián)在消減AK

3、致敏性方面的作用，首先對用于交聯(lián)的酶進行了篩選，結(jié)果顯示，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶與辣根過氧化物酶均不能有效促進AK交聯(lián)。酪氨酸酶可促進AK交聯(lián)，其反應條件為 AK經(jīng)45℃熱處理30 min后，在1600 U/mL酪氨酸酶和0.06μmo l/mL咖啡酸的作用下反應8 h。
　　在建立的酶法交聯(lián)結(jié)合熱處理條件下，采用蛋白組學和免疫組學方法分析AK的交聯(lián)程度、消化穩(wěn)定性、交聯(lián)產(chǎn)物（cross-linked thermal polymerize

4、d ariginine kinase, CL-pAK）的免疫結(jié)合活性，又進一步通過建立RBL-2H3細胞模型和BALB/c小鼠過敏模型評價其致敏性。電泳及電鏡結(jié)果顯示，在咖啡酸和酪氨酸酶催化下AK能夠有效交聯(lián)，產(chǎn)生大分子物質(zhì)。AK發(fā)生交聯(lián)后更耐胃蛋白酶消化，且消化產(chǎn)物IgG/IgE結(jié)合活性降低。抑制性ELISA檢測結(jié)果顯示，AK交聯(lián)后的半抑制濃度由1.13μg/mL升高至228.36μg/mL。BALB/c小鼠過敏模型結(jié)果顯示，CL-p