1、金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因qacA-B流行病研究;2、直接分子克隆法構建重組缺陷型腺病毒AdHu5-mfsp27基因及擴增與純化.pdf

1、第一部分金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因qacA/B分子流行病學研究
　　 目的:通過檢測我院2007年1月到2009年6月臨床分離的金黃色葡萄qacA/B基因,分析qacA/B在我院的流行情況,有利于指導臨床合理使用消毒劑。
　　 方法:用PCR法檢測mecA基因和qacA/B基因陽性率。以PFGE分型、spa分型、SCCmec分型及抗菌藥物耐藥譜表型分型對攜帶有qacA/B基因菌株進行同源性分析,結合臨床病歷資料,了解qa

2、cA/B在我院的分子流行病學特征。
　　 結果:qacA/B基因的檢出率為9.1％(12/176),mecA基因的檢出率為46.6%(82/176),MRSA中qacA/B攜帶率14.6%(12/82)顯著高于MSSA攜帶率(4/94),且差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Spa分型將16株SA分為8型,以t037和t042為主。PFGE分型將細菌分為A-G型,其中以A1、B、G分別屬于同一克隆。12株攜帶有qacA/B金黃色

3、葡萄球菌SCCmec基因分型為SCCmecⅢ型。
　　 結論:菌株的流行主要在外科病房。攜帶有qacA/B金黃色葡萄球菌在神經(jīng)外科ICU出現(xiàn)有一個流行克隆,其spa分型為t037。盡管其他病區(qū)qacA/B分布率低,但在MRSA流行率高的現(xiàn)狀下,對其進行流行病學檢測仍然具有重要意義。
　　 第二部分直接分子克隆法構建重組缺陷型腺病毒AdHu5-mfsp27基因及其擴增與純化
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4、NA片段化因子α效應蛋白家族,研究發(fā)現(xiàn)該基因可能為甘油三酯代謝途徑中的一個重要基因,與非酒精性肝病的發(fā)病有密切關系。將該基因高效導入細胞或動物體內(nèi)是詳細研究該基因功能的前提。
　　 目的:構建重組腺病毒非酒精性脂肪肝發(fā)病相關基因AdHu5-040-fsp27(cds)高效高質(zhì)量擴增和純化重組腺病毒以滿足體內(nèi)外實驗以及臨床試驗的需求。
　　 方法:直接分子克隆法構建重組腺病毒,目標基因首先克隆到穿梭質(zhì)粒,并位于兩個稀有限制

5、性內(nèi)切酶(I-ceuI and PI-sceI)后回收酶切片段后連接,然后線性化該重組腺病毒以釋放腺病毒載體基因組的反向末端重復序列(ITRs),利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒,HEK293細胞包裝,感染擴增大量制備體內(nèi)外實驗所需重組腺病毒。氯化銫梯度離心純化病毒并測定病毒的滴度。重組病毒MOI的測定。
　　 結果:成功構建pAdHu5-mfsp27(cds)。AdHu5-mfsp27經(jīng)擴增后的滴度(O.D.)為1×1013VP/mL;

6、MOI為1.44×1011,二者比值為69.44。重組腺病毒AdHu5-mfsp27可有效感染293包裝細胞,提示該重組腺病毒具有潛在的臨床應用價值。
　　 結論:本實驗利用直接分子克隆方法構建重組腺病毒AdHu5-mfsp27(cds)并高質(zhì)量擴增,解決了用同源重組的方法構建時難于挑選克隆,時間長成功率低的問題;利用高效液相柱,生物膠聯(lián)合氯化銫梯度離心技術純化病毒,簡化操作不需透析病毒,最大程度保存病毒活性,純度高,為下一步進