新霉素人工抗原的制備及鑒定.pdf

1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterSynthesisandidentificationofneomycinartificialantigenAuthor：HongChengSupervisor：ProfAipingWangMajor：BioengineeringEngineeringBiologicalEngineeringDepartmentMay2013

2、摘要新霉素(neomycin，NEO)是一種氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides)，因其具有高效、廣譜的抗菌作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和獸藥領(lǐng)域。新霉素雖然是重要的抗感染類藥物，但因其對(duì)人和動(dòng)物存在潛在的腎毒性和耳毒性等毒副作用，危害人體健康，使動(dòng)物源性食品安全受到威脅，而被多個(gè)國(guó)家禁止和限制使用。所以建立新霉素殘留的快速檢測(cè)方法十分必要。國(guó)內(nèi)外對(duì)新霉素殘留的檢測(cè)方法主要有理化方法、微生物法和免疫學(xué)分析方法。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法(

3、enzyme。linkedimmunosorbentassayELISA)因其具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，在獸藥殘留檢測(cè)的領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用，發(fā)展迅速。本研究旨在制備出具有良好免疫原性的新霉素人工抗原，對(duì)其進(jìn)行鑒定及免疫效果評(píng)價(jià)。由于新霉素為小分子半抗原，不具備免疫原性，應(yīng)用蛋白質(zhì)連接技術(shù)，將新霉素與牛血清白蛋白(bovineserumaibumin，BSA)、卵清蛋白(ovaibumin，OVA)進(jìn)行偶聯(lián)，制備出新霉素人工

4、抗原NEOBSA及NEOOVA，用紫外光譜分析法測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度，用紅外光譜分析法(瓜)、SDSPAGE電泳法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行初步鑒定；用NEOBSA免疫BALB／c小鼠，間接ELISA法測(cè)定多抗上清(pAb)抗體效價(jià)，阻斷ELISA法鑒定pAb敏感性，交叉反應(yīng)試驗(yàn)鑒定pAb特異性，綜合評(píng)價(jià)新霉素人工抗原的免疫效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：測(cè)定偶聯(lián)產(chǎn)物NEOBSA、NEOOVA的蛋白濃度分別為6344、4122mg／ml；NEOBSA的紅外光譜結(jié)果與

5、BSA相比，發(fā)生了相對(duì)明顯的改變，NEOBSA的電泳條帶與BSA的相比，NEOBSA相對(duì)滯后，并出現(xiàn)了明顯的拖尾現(xiàn)象，表明新霉素人工抗原制備成功。用NEOBSA免疫小鼠，獲得的pAb效價(jià)為1：3200，半數(shù)抑制濃度為105“g／ml，該pAb只與新霉素有強(qiáng)特異性反應(yīng)，與鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素的交叉反應(yīng)率均小于05％，與沙丁胺醇、土霉素交叉反應(yīng)率均小于01％。本研究制備出了具有良好免疫原性的新霉素人工抗原，為進(jìn)一步制備高親和力抗新霉素