陽明腑實證大鼠小腸神經-ICC-平滑肌網絡的損傷和下法施治機制研究.pdf

1、背景：陽明腑實證是指無形燥熱彌漫在經,充斥于表里內外,劫傷津液,腸中并無燥屎阻結的熱證;亦包括熱邪與宿食糟粕相搏結,津液被耗,形成有形的實邪壅滯在大腸致燥屎內結的腑實證。陽明腑實證患者有明顯胃腸運動障礙的表現(xiàn)。下法代表中藥方劑大承氣湯可有效地治療陽明腑實證。近些年來的研究表明腸神經和Caial間質細胞(interstitiacells of Cajal,ICC)以及平滑肌細胞間形成網絡狀連接(胃腸道神經-ICC-平滑肌網絡)。胃腸道神經

2、-ICC-平滑肌網絡與胃腸運動功能密切相關。
　　 目的：通過觀察陽明腑實證大鼠小腸組織中腸神經.ICC之間形態(tài)學結構的變化和小腸全厚肌層組織中ICC-平滑肌之間縫隙連接和ICC細胞超微結構的改變,探討陽明腑實證大鼠胃腸動力功能障礙時腸神經-ICC-平滑肌網絡的細胞形態(tài)學改變和細胞通訊傳導障礙機制以及大承氣湯的施治機制。
　　 方法：健康成年Wistar大鼠100只,隨機分為:對照組(20只)、陽明腑實證模型組(40只)

3、和大承氣湯治療組(40只)。對照組動物腹腔注射1.0ml生理鹽水。陽明腑實證模型組服熱性中藥、自身糞便灌胃,然后腹腔注射1.0ml E.coloi.混懸液建立陽明腑實證模型。治療組于造模成功后即給予大承氣湯灌胃,2次/日,每次1.0ml/100g,連用5日。取各組存活大鼠上段小腸組織制作小腸全厚肌層組織標本,進行c-Kit和乙酰膽堿能神經(vesicular acetylcholine transporter,VAChT),氮能神經(n

4、euronal nitric oxide synthase,nNOS),肽能神經(substance P,SP)和VIP神經(vasoactive intestinal peptide,VIP)免疫熒光雙標記染色后,激光掃描共聚焦顯微鏡檢測腸神經-ICC網絡結構的變化;免疫組化染色分析ICC-平滑肌網絡縫隙連接蛋白Cx43的表達,透射電鏡觀測ICC-平滑肌網絡和ICC超微結構的改變。
　　 結果：對照組:胃腸形態(tài)正常,腸管顏色呈

5、粉紅色,漿膜光澤鮮亮,腸管之間無粘連,胃腸蠕動頻率和形態(tài)正常。陽明腑實證模型組:胃腸極度擴張,胃內有大量氣體和內容物滯留,腸腔內大量液體潴留,多為糞水樣液體。大部分腸管肌層呈灰白色,肥厚,漿膜充血腫脹,偶可見黑色,散在的缺血表現(xiàn)。小腸系膜水腫肥厚,系膜根部淋巴結腫大。大網膜充血肥厚,有散出血斑點,腹腔內少量淡黃色清亮滲出液,部分出現(xiàn)血性腹水,壁層腹膜充血,肥厚,腹腔有明顯感染現(xiàn)象。胃腸蠕動頻率減少,存在明顯腸道運動功能減弱征象。治療組:

6、胃腸道擴張不明顯,胃腸腔內潴留物較少或胃內無物滯留。小腸漿膜壁紅潤,輕度肥厚,無充血,小腸壁和系膜水腫較輕,腹腔內未見血性腹水,腹腔無污染。腸道蠕動頻率較模型組明顯增加。
　　 共聚焦顯微鏡檢測腸神經-ICC網絡的變化。對照組:小腸ICC相互連接形成較完整的網絡樣結構。小腸膽堿能神經(VACHT)/氮能神經(NO)/肽能神經(SP)/VIP神經各自彼此相接形成網狀結構,神經網絡含有成串的神經節(jié)。ICC網絡圍繞著膽堿能神經/氮能神

7、經/肽能(SP)神經/VIP神經形成網絡,腸神經-ICC網絡結構完整。
　　 模型組較對照組小腸ICC數(shù)量明顯減少(p＜0.01),細胞熒光強度明顯減弱,彼此之間的網絡樣結構不完整。與對照組比較,小腸膽堿能神經(VACHT)/氮能神經神經(NO)/肽能神經(SP)/VIP神經纖維數(shù)目明顯減少(p＜0.01),彼此間的連接減少,神經網絡結構紊亂;神經網絡的熒光強度減弱(p＜0.01),ICC與腸神經纖維間的連接松散或消失,網絡結構

8、不完整,腸神經-ICC網絡結構遭受明顯破壞。
　　 治療組較模型組小腸ICC數(shù)量明顯增多(p＜0.01),網絡樣結構的完整性有所恢復。與模型組比較,ICC細胞熒光強度明顯增強(p＜0.01)。治療組小腸膽堿能神經(VACHT)/氮能神經神經(NO)/肽能神經(SP)/VIP神經神經纖維數(shù)目明顯增加(p＜0.01)。神經網絡結構好轉,彼此間的網絡連接的完整性恢復明顯,神經網絡的熒光強度增加(p＜0.01)。ICC與腸神經纖維間的連

9、接接近正常,ICC-腸神經網絡結構恢復明顯。
　　 免疫組化觀察分析連接蛋白Cx43對照組的小腸縱肌層大部分細胞存在呈陽性表達的Cx43蛋白,環(huán)肌層有少數(shù)細胞呈弱陽性表達,肌間神經叢處大部分細胞呈陽性表達。模型組小腸肌層Cx43蛋白陽性灰度較對照組減弱(p＜0.01),尤其以縱肌層明顯。治療組與模型組比較,Cx43蛋白陽性灰度增強(p＜0.01),尤其以縱肌層明顯。
　　 透射電鏡觀察對照組大鼠ICC特征:①胞質和突起內

10、含豐富的線粒體、可見內質網和發(fā)育良好的高爾基體;②有膜內陷空泡;③有較多中間絲,無粗肌絲;④非常接近三級神經束;⑤ICC相互之間、與平滑肌細胞間可見縫隙連接(gapjunctions);神經纖維末梢與平滑肌細胞見緊密連接,間距約為100nm左右,形成完整的神經-ICC-平滑肌網絡形態(tài)學基礎。模型組大鼠ICC細胞突起明顯減少或消失,大量神經纖維末梢腫脹,伴隨神經遞質小泡減少或消失;平滑肌細胞粗面內質網擴張,高爾基體腫脹,出現(xiàn)大量細胞膜內陷

11、空泡,相互間的縫隙連接缺失;ICC與神經纖維間的突觸樣連接缺如,間距增加:ICC相互間及其與平滑肌細胞間縫隙連接消失,存在較大間隙,神經-ICC-平滑肌網絡形態(tài)學基礎受到明顯損傷。治療組大鼠部分ICC細胞突起損傷不明顯;神經組織末梢較為豐富,少量神經纖維末梢腫脹,神經遞質小泡無明顯減少;平滑肌細胞損傷不明顯,有少量細胞膜內陷空泡;ICC與神經纖維間保持突觸樣連接;ICC相互間及ICC與平滑肌細胞間存在縫隙連接,無明顯間隙;組織間隙內存在

12、少量液性物質,神經-ICC-平滑肌網絡形態(tài)基本保持完整。
　　 結論：陽明腑實證大鼠胃腸擴張,胃腸功能紊亂征象明顯;大承氣湯能夠顯著改善胃腸運動功能功能。
　　 陽明腑實證時,小腸膽堿能神經(VACHT)/氮能神經(NO)/肽能神經(SP)/VIP神經數(shù)目減少;神經網絡結構遭到破壞,ICC數(shù)量減少,ICC網絡結構破壞,腸神經-ICC之間網絡結構受到破壞。由于小腸上行興奮性神經和下行的抑制性神經形態(tài)學改變以及他們之間的網絡

13、破壞,導致神經之間的傳導功能改變。這可能是陽明腑實證大鼠小腸胃腸動力功能障礙的細胞形態(tài)學基礎。大承氣湯可能通過抑制炎癥,抗菌、抑制內毒素吸收,以及穩(wěn)定細胞膜等功能增加陽明腑實證大鼠小腸腸神經和ICC的細胞數(shù)量,維持腸神經-ICC網絡結構的完整。進而恢復小腸運動功能。
　　 陽明腑實證時,大鼠小腸肌層ICC-平滑肌網絡縫隙連接蛋白Cx43陽性表達減少,細胞通訊功能蛋白減少。是陽明腑實證大鼠胃腸動力功能改變的細胞學病理基礎。ICC-

14、平滑肌細胞之間縫隙連接消失或間隙增加,導致腸神經-ICC-平滑肌細胞網絡的信號傳導通路破壞。大承氣湯治療后,大鼠小腸肌層ICC-平滑肌網絡縫隙連接蛋白Cx43陽性表達增多,ICC-平滑肌細胞之間縫隙連接間隙接近正常,小腸肌層ICC-平滑肌網絡細胞間通訊傳導通路恢復。
　　 以上結果提示,陽明腑實證大鼠小腸腸神經-ICC-平滑肌細胞網絡結構改變是胃腸道動力障礙的細胞學基礎,大承氣湯能夠減輕腸神經-ICC-平滑肌三者間結構的損傷,維