酶法催化合成利巴韋林的研究.pdf

1、利巴韋林是一種廣譜抗病毒藥物，可由嘌呤核苷磷酸化酶催化核糖-1-磷酸和1，2，4-三氮唑-3-甲酰胺(TCA)合成。利巴韋林對多種DNA和RNA病毒均具有較好的抑制作用，具有作用位點(diǎn)多、不易產(chǎn)生耐藥性、療效高、毒性低，副作用小等特點(diǎn)，現(xiàn)已用于多種病毒的治療。
　　根據(jù)前期篩選得到的具有較高催化效率的三聚體嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)，使用實驗室保存的誘導(dǎo)型表達(dá)載體pQE30-pupG和組成型載體pQF-pupG分別轉(zhuǎn)化4株大腸

2、桿菌XL1-Blue、BL21(DE3)、DH5α、K27，獲得8株工程菌株。采用全細(xì)胞催化合成利巴韋林，E.coli XL1-Blue和BL21都要比DH5α和K27表現(xiàn)出更高的活力。E.coli BL21使用乳糖為誘導(dǎo)劑，比IPTG可以獲得更多的菌體，且單位細(xì)胞的催化活力相當(dāng)。乳糖誘導(dǎo)系統(tǒng)操作簡單、所需成本低，具有重要的工業(yè)化應(yīng)用價值。用乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的E.coli BL21細(xì)胞30g/L（濕重）為催化劑，在pH7.6磷酸鹽緩沖液中，

3、添加鳥苷和TCA各100 mmol/L，55℃反應(yīng)20 h，利巴韋林產(chǎn)量可達(dá)17.6 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為72.1％。
　　為了獲得更高的酶活，本論文構(gòu)建了誘導(dǎo)型表達(dá)載體pET-His-pupG，pET系列載體是大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白最強(qiáng)大的系統(tǒng)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得工程菌株。采用全細(xì)胞催化合成利巴韋林發(fā)現(xiàn)使用乳糖作為誘導(dǎo)劑比IPTG能產(chǎn)生出更多的細(xì)胞，且單位細(xì)胞的催化能力并沒有降低。以乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的E.

4、coli BL21細(xì)胞30 g/L(濕重)為催化劑，在pH7.6磷酸鹽緩沖液中，鳥苷和TCA各100 mmol/L，55℃反應(yīng)20 h，利巴韋林產(chǎn)量可達(dá)19.5 g/L，底物轉(zhuǎn)化率為79.9％。
　　研究發(fā)現(xiàn)游離細(xì)胞催化合成利巴韋林時，游離細(xì)胞容易裂解，難以重復(fù)利用。本論文通過將重組菌BL21(pET-His-pupG)固定化后，穩(wěn)定性大幅提高并能反復(fù)使用。選擇不同包埋凝膠對重組菌固定化，通過對比確定明膠為最佳包埋劑。通過優(yōu)化明膠

5、固定化條件，發(fā)現(xiàn)最適溫度55℃，最佳菌體包埋量為200 g/L，固定化細(xì)胞使用量20g/L，反應(yīng)周期20 h。對于固定化細(xì)胞催化合成利巴韋林，在pH7.6的磷酸鹽緩沖液中，底物鳥苷和TCA各100 mmol/L，在最優(yōu)條件下，連續(xù)反應(yīng)8批次后固定化細(xì)胞酶活力基本沒有損失，轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)到83.0％。
　　本文針對利巴韋林轉(zhuǎn)化液的特征，確定了合適的提取純化工藝。研究了活性炭用量、脫色時間和脫色溫度對轉(zhuǎn)化液脫色效果的影響，通過測定脫色