用分子印跡技術(shù)分離純化菇類抗氧化成分以及該成分在氧化應(yīng)激中的保護(hù)機(jī)制.pdf

1、天然抗氧化成分因具有高效低毒和多重抗氧化活性而備受研究者的關(guān)注。菇類作為一種重要的天然資源是抗氧化活性成分的主要來(lái)源之一。
　　本研究利用分子印跡技術(shù)，以天然抗氧化活性成分為模板分子，采用本體聚合法合成分子印跡聚合物，從致孔劑、功能單體以及交聯(lián)劑等方面對(duì)分子印跡聚合物的制備過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，并將制備的分子印跡聚合物作為固相萃取的吸附材料，從菇類提取物中分離富集天然抗氧化成分。分子印跡聚合物的制備和應(yīng)用主要從以下三方面進(jìn)行:
　　

2、(1)以咖啡酸苯乙酯為模板分子，4-乙烯吡啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，四氫呋喃和異辛烷的混合溶液作為致孔劑合成分子印跡聚合物。實(shí)驗(yàn)考察了分子印跡聚合物對(duì)模板分子咖啡酸苯乙酯和結(jié)構(gòu)類似物咖啡酸的選擇性，并通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)和吸附等溫線對(duì)聚合物進(jìn)行表征。將咖啡酸苯乙酯分子印跡聚合物作為固相萃取的吸附材料，從25種菇類中分離富集咖啡酸苯乙酯和咖啡酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從7種菇類中檢測(cè)到咖啡酸的存在，含量在0.004-0.340μg g

3、-1（dw）之間，其中裂褶菌、巴氏蘑菇、杏鮑菇、黃傘以及鮑魚(yú)菇為首次報(bào)道分離到咖啡酸。此外，與商品化C18柱相對(duì)比，分子印跡柱對(duì)目標(biāo)物表現(xiàn)出較好的親和性和選擇性。
　　(2)以沒(méi)食子酸為模板分子，4-乙烯吡啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，四氫呋喃和異辛烷的混合溶液作為致孔劑合成分子印跡聚合物。本實(shí)驗(yàn)比較了模板分子沒(méi)食子酸和4種結(jié)構(gòu)類似物（焦性沒(méi)食子酸、間苯二酚、原兒茶酸以及3，5-二羥基甲苯）在分子印跡柱上的吸附能力，

4、并對(duì)聚合物的吸附性能進(jìn)行表征。沒(méi)食子酸分子印跡聚合物對(duì)于模板分子沒(méi)食子酸表現(xiàn)出選擇性高、傳質(zhì)速度快等特點(diǎn)。25 mg L-1的沒(méi)食子酸在50 mg分子印跡物中靜態(tài)吸附120 min后，基本達(dá)到平衡。將沒(méi)食子酸分子印跡柱應(yīng)用于25種菇類粗提物的分離純化，并從9種菇類中檢測(cè)到?jīng)]食子酸，含量在0.044-0.528μg g-1（dw）之間，其中從鹿茸菌中分離得到了沒(méi)食子酸的結(jié)構(gòu)類似物原兒茶酸。本實(shí)驗(yàn)對(duì)沒(méi)食子酸分子印跡柱與商品化C18柱對(duì)菇類粗

5、提物的分離效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，分子印跡柱能夠特異性的富集沒(méi)食子酸，而C18柱對(duì)菇類粗提物的吸附能力較差。
　　(3)以硬毛素為模板分子、丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯作為功能單體和交聯(lián)劑、四氫呋喃和異辛烷的混合溶液作為致孔劑制備得到的分子印跡聚合物對(duì)模板分子硬毛素表現(xiàn)出較強(qiáng)的選擇性，對(duì)硬毛素的吸附能力明顯強(qiáng)于結(jié)構(gòu)類似物hispolon和inotilone。同樣，通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)模型和吸附等溫模型對(duì)分子印跡聚合物的吸附性能進(jìn)行了

6、評(píng)價(jià)。以此分子印跡物作為固相萃取吸附填料對(duì)8種菇類提取物進(jìn)行分離富集，從3種菇類中檢測(cè)到硬毛素，其中桑黃中硬毛素的含量最高，為8.44μg g-1（dw）。與商品化C18柱相比，以分子印跡聚合物作為吸附材料的固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物表現(xiàn)出特異的吸附能力，從而起到富集目標(biāo)物、純化樣品的目的。
　　為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)所合成的分子印跡聚合物對(duì)目標(biāo)活性成分的分離富集能力，本研究檢測(cè)了菇類粗提物在經(jīng)過(guò)分子印跡柱萃取后，樣品的抑制紅細(xì)胞溶血活性、抑制脂

7、質(zhì)過(guò)氧活性以及超氧陰離子清除活性的變化情況，從抗氧化活性的角度考察分子印跡柱的分離富集效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)含有目標(biāo)活性成分的菇類粗提物在經(jīng)過(guò)分子印跡柱萃取分離后，其抗氧化活性有所提高，說(shuō)明菇類粗提物中的雜質(zhì)成分被去除的同時(shí)活性成分得到富集。
　　氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞氧化損傷而造成的細(xì)胞凋亡在疾病的發(fā)生和發(fā)展中所起到的作用越來(lái)越受到研究人員的關(guān)注。因此，對(duì)活性氧造成機(jī)體氧化損傷的機(jī)制以及抗氧化活性成分作用途徑的研究尤為重要。本研

8、究利用H2O2誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞氧化損傷構(gòu)建細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，以從美味牛肝菌、鹿茸菌和桑黃中分離得到的活性成分Be、Rf和Pi作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，評(píng)價(jià)天然抗氧化成分對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。H2O2的暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠脾細(xì)胞存活率的下降，并且與H2O2呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性關(guān)系。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠明顯提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。Be、Rf和Pi能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞氧化損傷，使細(xì)胞存活率從63.7％提高到73.7-77.7％，

9、并且與活性成分的濃度呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，同時(shí)三種活性成分的預(yù)保護(hù)可以抑制H2O2誘導(dǎo)的胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步研究活性成分的作用途徑，本研究從線粒體依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為切入點(diǎn)，探討天然活性成分發(fā)揮其抗氧化活性的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞氧化損傷主要是通過(guò)線粒體依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的，并未激活死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路中的Fas/FasL途徑。天然活性成分對(duì)H2O2誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)

10、作用與其對(duì)細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用密切相關(guān)。Be、Rf和Pi都能不同程度的提高因H2O2造成的細(xì)胞線粒體膜電位降低，恢復(fù)線粒體正常生理功能。同時(shí)，也抑制了線粒體內(nèi)促凋亡因子細(xì)胞色素C的釋放?；钚猿煞诌€能通過(guò)提高抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)量，抑制Caspase-3、Caspase-9激活的方式阻斷活性氧介導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。抑制細(xì)胞凋亡，從而起到抗氧化作用。
　　本研究將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于菇類中天然抗氧化成分的分離純化，并對(duì)