還原性糖鏈的靶板衍生化MALDI-TOF-MS分析方法建立及應用研究.pdf

1、糖類物質有著重要的生物學功能，如參與細胞識別、信號轉導及與受體的相互作用等。質譜(MS)已在生物大分子的分析檢測中得到廣泛應用。但是由于生物來源糖鏈結構高度復雜、表達具有微觀不均一性，具有多羥基，有的含唾液酸，極性大，影響其在MS分析時的離子化效率和檢測靈敏度。通過化學衍生法改善糖鏈疏水性或電離特性，可提高樣品在MS檢測分析中的離子化效率和分析靈敏度。但現有衍生化反應一般需要多個步驟和處理過程（唾液酸易丟失），樣品用量較大，需純化富集才

2、能進行MS分析，不利于微量生物來源寡糖鏈的分析和檢測。因而，已有研究利用MALDI-TOF-MS分析樣品時基質（含三氟乙酸）作催化劑，在靶板上對還原性糖鏈與氨基類試劑在室溫條件下進行標記，待靶板干燥，即可直接進行后續(xù)MALDI-TOF-MS分析。但是，該類方法存在衍生化效率低、唾液酸易丟失等缺陷?；诖?，本研究選用肼基衍生化試劑，在生理條件下與還原性糖鏈進行標記，擬建立還原性糖鏈靶板直接衍生化用于提高MALDI-TOF-MS靈敏度的分析

3、方法，解決現有靶板衍生化效率低，唾液酸易丟失的缺陷。結果如下:
　　(1)以乳糖為標準，優(yōu)化了吉拉德T(Girard's T，GT)靶板衍生化條件。建立了靶板直接衍生化用于提高還原性糖MALDI-TOF-MS靈敏度分析的方法。以Maltodextrin為標準糖鏈，經GT衍生化后，MALDI-TOF-MS檢測衍生化效率為95％。對方法的線性范圍、檢測限、重復性和穩(wěn)定性進行了評估。結果表明:在128倍濃度范圍內（0.78nmol/mL

4、-10.00μmol/mL）方法穩(wěn)定(R2=0.9992);重復性良好(RSD=3.06％);在10天之內，檢測穩(wěn)定性良好(RSD=2.95％)，最低檢測限為0.15ng。采用內標法定量，結果顯示乳糖、來源于Ovalbumin和RNase B的N-糖鏈衍生化后質譜檢測靈敏度分別提高了22.92、10.20和9.17倍。將方法應用于羊乳總蛋白N-糖鏈和人乳游離寡糖鏈靶板衍生化分析。結果顯示，衍生化后可以同時檢測中性糖和唾液酸化糖鏈，未發(fā)現

5、唾液酸丟失現象;并且可以檢測出低豐度糖鏈（未衍生化時檢測不到），提高了質譜分析靈敏度。
　　(2)本研究選用不同電荷性質的8種肼基試劑（吉拉德P、吉拉德T、苯肼、苯磺酰肼、苯甲酰肼、氨基硫脲、4-苯基-3-氨基硫脲、4-肼基苯甲酸），對還原性糖鏈靶板衍生化效率和后續(xù)質譜效果進行比較分析。以Maltodextrin和胎牛血清N-糖鏈為標準糖鏈進行衍生化效率對比。結果表明:在等摩爾量衍生化試劑條件下，對于中性糖Maltodextrin

6、靶板衍生化后，試劑的靶板衍生化效率由高到低依次為:GP=GT＞PNH＞BZH=TSC＞PTSC=HBA＞BSH;對于唾液酸化N-糖鏈（胎牛血清）靶板衍生化后，試劑的衍生化效率由高到低依次為GP＞GT＞PNH＞BSH＞PTSC＞HBA＞BZH＞TSC。結果表明，GP適宜于中性和酸性糖的靶板衍生化，且不引起唾液酸丟失。胎牛血清N-糖鏈經GP衍生化后檢測靈敏度提高了14.00倍，最低檢測限為75.00 pg。該方法已成功應用于微量樣品（大豆總