安體舒通抑制肝星狀細(xì)胞收縮對(duì)門靜脈高壓調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 眾所周知,各種慢性肝病可經(jīng)肝纖維化發(fā)展為肝硬化,門靜脈高壓是肝硬化的嚴(yán)重并發(fā)癥。肝硬化狀態(tài)下,肝內(nèi)血管阻力的增加是導(dǎo)致門靜脈高壓的重要因素。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展以及門脈高壓形成等一系列過(guò)程中起關(guān)鍵作用。受到外界刺激后,處于靜息狀態(tài)的HSC轉(zhuǎn)化成為活化的HSC,具有肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的特征,不斷增殖,并獲得收縮性。當(dāng)HSC發(fā)生強(qiáng)烈收縮,致使肝竇

2、直徑縮小,肝內(nèi)血管阻力增大；同時(shí)可引起肝組織瘢痕攣縮,進(jìn)一步增加肝內(nèi)血管阻力,導(dǎo)致門靜脈高壓?？梢?HSC收縮的調(diào)控機(jī)制是門靜脈高壓機(jī)理研究的重要一環(huán)。
　　 近年來(lái),肝內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)已成為肝纖維化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)和醛固酮(Aldosterone,ALD)是RAAS的重要效應(yīng)分子,可誘導(dǎo)HSC的活化和增殖而促進(jìn)肝纖維化的形成。肝內(nèi)ACE-AngⅡ-AT

3、1R軸與門靜脈高壓的形成有密切的關(guān)系。近年的研究認(rèn)為,RAAS不僅僅存在于循環(huán)系統(tǒng),更重要的是局部組織器官,如肝臟、腎臟及心臟中也發(fā)現(xiàn)有RAAS。臨床上,ALD拮抗劑-安體舒通(Spironolactone)在半世紀(jì)前已經(jīng)在心血管、腎臟病和肝臟病領(lǐng)域得到了廣發(fā)應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,安體舒通的代謝物之一,螺內(nèi)酯,可用于降低肝門靜脈壓力梯度(HVPG),改善門靜脈壓力。另?yè)?jù)臨床研究發(fā)現(xiàn),安體舒通在治療門靜脈高壓的應(yīng)用過(guò)程中,與心得安、生長(zhǎng)抑素等

4、藥物所發(fā)揮的藥理作用不同,無(wú)降低患者血壓、減慢心率等副作用,但安體舒通具體降低門靜脈高壓的機(jī)制迄今仍不明確。
　　 HSC活化后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,具有平滑肌細(xì)胞的特征,提示HSC收縮和平滑肌細(xì)胞收縮的分子機(jī)制是類似的,可通過(guò)鈣離子依賴性和非鈣離子依賴性兩種通路完成收縮。在非鈣途徑中,RhoA/ROCK通路對(duì)HSC收縮的調(diào)控機(jī)制是近年研究的熱點(diǎn)。因此,本研究通過(guò)體外試驗(yàn),觀察安體舒通通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA/Roek信號(hào)通路上各元

5、件的表達(dá)而對(duì)HSC收縮的影響,及其具體的分子機(jī)制；通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn),觀察安體舒通對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞收縮的影響,及參與門脈高壓調(diào)控的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.安體舒通對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞系收縮的影響:采用HSC-T6細(xì)胞株,激光共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察HSC-T6胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化；電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；聚硅酮膜培養(yǎng)法(Silicone-rubber-membrane)和Ⅰ型鼠尾膠原法(TypeⅠ rat-

6、tail collagen)觀察HSC-T6的收縮；TRITC-鬼筆環(huán)肽(TRITC-phalloidin)標(biāo)記肌動(dòng)蛋白(F-actin)顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布和動(dòng)態(tài)變化。
　　 2.安體舒通抑制醛固酮誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞收縮機(jī)制的體外研究:采用HSC-T6細(xì)胞株,提取不同時(shí)間點(diǎn)(0min,5min,15min,30min,60min,120min)和不同ALD濃度(0.01nM,0.1nM,1nM,10nM,100nM)刺激下的

7、總蛋白,免疫印跡法檢測(cè)肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)和磷酸化MLC(P-MLC)表達(dá)水平；分別給予ALD抑制劑(10 nM Spironolactone)、ROCK-2抑制劑(10 nM Y27632)預(yù)處理1h,ALD(1nM)與Spironolactone(10 nM)、ALD(1nM)與Y27632(10 nM)共處理15min后,Pull-down GST法提取不同組別RhoA GTP活性蛋白,免疫

8、印記法檢測(cè)RhoA GTP蛋白表達(dá)水平；分別提取不同組別細(xì)胞膜蛋白,免疫印跡法檢測(cè)Ras、RhoA蛋白表達(dá)水平；提取不同組別細(xì)胞總蛋白,免疫印跡法檢測(cè)RhoA/ROCK通路上P-moesin和moesin、P-MLC和MLC蛋白表達(dá)水平；提取不同組別細(xì)胞內(nèi)RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR,QRT—PCR)檢測(cè)RhoA/ROCK通路Rho GEFs(RhoGuanine

9、Nucleotide Exchange Factors,Rho GEFs)、RhoA GTP及ROCK-2(Rhokinase)mRNA的表達(dá)。
　　 3.安體舒通抑制肝星狀細(xì)胞收縮對(duì)門脈高壓調(diào)控機(jī)制的體內(nèi)研究:針對(duì)假手術(shù)模型(Sham)、雙重膽管結(jié)扎構(gòu)建肝纖維化大鼠模型(BDL)及在BDL基礎(chǔ)上安體舒通治療模型(BDL+Sp),通過(guò)對(duì)肝組織HE染色及Masson染色進(jìn)行ISHAK及METAVIR肝纖維化評(píng)分；雙抗體夾心法測(cè)定不

10、同組別大鼠肝組織羥脯氨酸(Hyp)水平；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)磷酸化moesin(ROCK-2底物)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)蛋白表達(dá)；提取不同組別肝組織總蛋白,免疫印跡法檢測(cè)RhoA/ROCK通路上RhoA、P-MLC和MLC、P-moesin和moesin及α-SMA蛋白表達(dá)水平；提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,QRT-PCR法檢測(cè)RhoA/ROCK通路RhoA GTP及ROCK-2(Rho kinase)mRNA的表達(dá)；彩色多

11、普勒血流超聲檢測(cè)(CDFI)檢測(cè)肝門靜脈血流速度及肝門靜脈內(nèi)徑；原位肝灌注法檢測(cè)肝外門靜脈壓力及肝內(nèi)血管阻力。
　　 結(jié)果：
　　 1.安體舒通對(duì)ALD誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞收縮的影響
　　 ALD對(duì)HSC胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化無(wú)顯著性影響；在電子掃描顯微鏡下可見安體舒通能夠抑制ALD刺激后細(xì)胞伸展,體積增大；激光共聚焦顯微鏡觀察可見經(jīng)FITC-phalloidine染色的細(xì)胞骨架中的微絲(F-action),安

12、體舒通能夠顯著抑制ALD誘導(dǎo)的F-action數(shù)量增多；聚硅酮膜培養(yǎng)法和Ⅰ型鼠尾膠原法可觀察到ALD可誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞收縮,而安體舒通能夠抑制ALD誘導(dǎo)HSC—T6細(xì)胞收縮的效應(yīng)。
　　 2.安體舒通抑制ALD誘導(dǎo)HSC-T6收縮機(jī)制的體外研究
　　 ALD可誘導(dǎo)磷酸化MLC蛋白水平的變化,并呈時(shí)間、濃度依賴性,在InM濃度刺激15min達(dá)到峰值后逐漸減低；在蛋白水平,安體舒通能夠顯著抑制ALD誘導(dǎo)的RhoA GTP

13、活性蛋白(P=0.001)、moesin蛋白磷酸化(P=0.000)及MLC蛋白磷酸化(P=0.000)增高水平,而Y27632(RhoA激酶抑制劑)也能夠顯著降低RhoA GTP活性蛋白(P=0.000)、moesin蛋白磷酸化(P=0.000)、MLC蛋白磷酸化(P=0.006)水平；在基因表達(dá)水平,ALD處理組Rho GEFs(P=0.001)、RhoA GTP(P=0.009)、ROCK-2 mRNA(P=0.002)的表達(dá)顯著

14、增強(qiáng),ALD+Sp處理組三種元件的表達(dá)均顯著減弱(均P<0.01)。ALD+Y27632聯(lián)合處理組也能夠顯著減低上述三種元件的表達(dá)水平(均P<0.01)。
　　 3.安體舒通抑制肝星狀細(xì)胞收縮對(duì)門脈高壓調(diào)控機(jī)制的體內(nèi)研究
　　 通過(guò)對(duì)Sham組、BDL組及BDL+Sp組大鼠肝組織HE染色及Masson染色進(jìn)行ISHAK及METAVIR肝纖維化評(píng)分發(fā)現(xiàn),BDL組肝纖維化評(píng)分顯著高于Sham組(P=0.000),而BDL+S

15、p組能夠顯著降低BDL組肝纖維化評(píng)分(P=0.000),但兩者均較Sham組高；不同組別大鼠肝組織中HYP含量顯示,BDL組大鼠肝組織中Hyp含量顯著高于Sham組(P=0.000),而BDL+Sp組肝組織中Hyp含量顯著低于BDL組(P=0.000)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),肝內(nèi)只有一小部分細(xì)胞表達(dá)P-moesin和α—SMA蛋白,而且僅限于小葉中心靜脈周圍的肝細(xì)胞。在大鼠膽管結(jié)扎處理4周后,肝臟P-moesin和α-SMA表

16、達(dá)水平明顯增加,而且廣泛分布,從肝小葉到纖維間隔均可見P-moesin和α-SMA免疫反應(yīng)細(xì)胞。此外,安體舒通治療組大鼠肝臟中P-moesin和α-SMA染色較膽管結(jié)扎組減弱,包括陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及染色信號(hào)強(qiáng)度均減弱；在蛋白水平,BDL組大鼠肝組織內(nèi)RhoA/ROCK通路上RhoA、P-MLC、P—moesin及α-SMA蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.01),BDL+Sp組大鼠肝組織內(nèi)上述蛋白水平下降,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P

17、；在基因水平,BDL組大鼠肝組織內(nèi)RhoA/ROCK通路上RhoAGTP及ROCK-2 mRNA的表達(dá)均顯著升高(分別P=0.001、P=0.000),BDL+Sp大鼠肝組織內(nèi)上述基因水平下降,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.000)。
　　 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)變化在于:CDFI檢測(cè)可見BDL組較Sham組大鼠肝臟表面明顯不平、呈鋸齒狀或波浪狀,肝臟內(nèi)部回聲多表現(xiàn)增強(qiáng),光點(diǎn)增粗,分布均勻或不均勻,有時(shí)見網(wǎng)狀較強(qiáng)回聲的分隔。肝靜脈可受擠壓

18、變細(xì)或粗細(xì)不均勻。與Sham組大鼠相比,血液額譜低平,正常的輕度波動(dòng)消失,門靜脈主干內(nèi)血流速度減低(P=0.000),并且門靜脈內(nèi)徑增寬(P=0.000),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。超聲探頭檢測(cè)可見BDL+Sp組門靜脈主干內(nèi)血流速度較BDL組(P=0.000)及Sham組(P=0.000)血流速度都顯著增快,但BDL+Sp組沒能有效降低門靜脈內(nèi)徑(P=0.202)；各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果表明,BDL組大鼠肝門靜脈內(nèi)徑、肝門靜脈血流速度較Sha

19、m組均顯著性增加(P=0.000),與此同時(shí),BDL+Sp組肝門靜脈壓力及肝內(nèi)血管阻力均較前者顯著性下降(P=0.000)。
　　 結(jié)論:
　　 1.安體舒通能夠有效抑制醛固酮誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞收縮,這種收縮與細(xì)胞胞內(nèi)游離鈣離子濃度無(wú)顯著性關(guān)系。
　　 2.安體舒通能夠顯著降低醛固酮誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞RhoA/ROCK通路上相關(guān)分子基因和蛋白的表達(dá),從而抑制醛固酮誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞收縮。
　　 3.安體舒通能夠顯