直投式發(fā)酵泡菜益生乳酸菌的選育與菌劑制備及其益生特性研究.pdf

1、泡菜是我國歷史悠久且風味獨特的一類冷加工蔬菜制品。目前我國的泡菜生產(chǎn)企業(yè)仍沿用自然發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝,發(fā)酵菌種雜且未經(jīng)鑒定、發(fā)酵條件難控制、產(chǎn)品質(zhì)量難穩(wěn)定,存在一定食品安全隱患,這些問題己嚴重制約了我國泡菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。鑒于目前泡菜生產(chǎn)中存在的現(xiàn)實問題,本文開展了直投式發(fā)酵泡菜益生乳酸菌的選育和菌劑制備及其益生特性研究,研制出直投式泡菜發(fā)酵益生乳酸菌劑進行泡菜發(fā)酵,既可解決我國泡菜產(chǎn)業(yè)中長期存在的食品穩(wěn)定性和安全性問題,又可生產(chǎn)出具有良好保健

2、功能的泡菜產(chǎn)品,達到高值高效轉(zhuǎn)化大宗蔬菜農(nóng)產(chǎn)品的目的。本研究可建立我國泡菜產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)創(chuàng)新平臺,扭轉(zhuǎn)我國發(fā)酵菌劑產(chǎn)品長期依賴進口的被動局面,為我國的經(jīng)濟建設和解決“三農(nóng)”問題做出重要貢獻。本文主要研究內(nèi)容與結(jié)論如下:
　　 1、研究了我國傳統(tǒng)泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌菌系變化及其消長規(guī)律。結(jié)果顯示:腸膜明串珠菌腸膜亞種、糞腸球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、植物乳桿菌、干酪乳桿菌和玉米乳桿菌主導整個泡菜發(fā)酵過程。腸膜明串珠菌腸膜亞種和糞腸球菌

3、在泡菜發(fā)酵初期(Od)即存在于泡菜發(fā)酵液中,而其它四種乳酸菌是在發(fā)酵過程中相繼出現(xiàn)。糞腸球菌和乳酸乳球菌乳酸亞種主要存在于泡菜發(fā)酵早期,在發(fā)酵中期就從泡菜發(fā)酵液中消失了。腸膜明串珠菌腸膜亞種到5d時從泡菜發(fā)酵液中消失了。玉米乳桿菌主要存在于泡菜發(fā)酵中期,到5.5d時泡菜發(fā)酵液中已檢測不到了。植物乳桿菌和干酪乳桿菌主要存在于泡菜發(fā)酵的中后期并完成整個發(fā)酵過程。研究結(jié)果闡明:腸膜明串珠菌是典型的異型乳酸發(fā)酵菌,啟動整個泡菜發(fā)酵過程,其產(chǎn)生的

4、CO2為其他參與泡菜發(fā)酵的乳酸菌生長提供了厭氧條件;隨后是糞腸球菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、玉米乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌等參與泡菜的中期發(fā)酵,大量產(chǎn)酸,是典型的同型乳酸發(fā)酵過程;最后由植物乳桿菌、干酪乳桿菌完成整個泡菜發(fā)酵過程。
　　 2、根據(jù)泡菜發(fā)酵菌系的研究結(jié)果,本研究設計目的培養(yǎng)基,從中國傳統(tǒng)泡菜老液中篩選出泡菜發(fā)酵性能優(yōu)良、能耐高濃度膽鹽和酸環(huán)境,能通過模擬人體胃屏障,順利到達腸道的功能性泡菜發(fā)酵專用菌株。通過泡菜發(fā)酵

5、性能測定,篩選出其中發(fā)酵性能最佳的編號NCU116菌株,經(jīng)生理生化、16S Rrna和pheS基因序列分析鑒定,確定該菌株為植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)。
　　 3、應用響應面法優(yōu)化植物乳桿菌NCU116平衡培養(yǎng)基配方,利用中和法與指數(shù)流加法研究植物乳桿菌NCU116高密度培養(yǎng)條件。結(jié)合單因素實驗結(jié)果,采用SAS軟件進行中心組合設計和響應面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)

6、化后的平衡培養(yǎng)基配方為:葡萄糖5.43％、蛋白胨0.98%、K2HPO40.59%;研究植物乳桿菌NCU116高密度培養(yǎng)條件,利用15L全自動發(fā)酵罐,在接種量3%、Ph6.5、培養(yǎng)溫度35℃的最佳條件下,采用氨水中和法和指數(shù)流加碳、氮源培養(yǎng)基,最終發(fā)酵液中植物乳桿菌NCU116菌體濃度達到9.3×10~CFU/Ml。
　　 4、采用單因素實驗和正交實驗設計篩選和優(yōu)化植物乳桿菌NCU116真空冷凍干燥的保護劑配方;研究了離心條件、

7、離心前發(fā)酵液Ph值、物料厚度和預冷凍時間等凍干條件對細胞活性的影響,測定了其共晶點、共熔點和崩解溫度,并研究了快速凍干和慢速凍干的效果,以及兩步法真空冷凍干燥技術(shù)條件。最終確定兩步法真空冷凍干燥技術(shù)參數(shù)為:保護劑5%海藻糖、10%脫脂奶粉和2%甘油;離心前發(fā)酵液Ph6.0,4000r/min離心15min,共晶點溫度為-31℃,共熔點溫度為-30.8℃,崩解溫度范圍為-32.9℃～-27℃,快速凍干效果高于慢速凍干,平皿中物料厚度4mm

8、,34℃真空干燥2h,-50℃下預冷凍2h,再真空冷凍干燥18h。兩步法真空冷凍干燥后樣品菌體濃度達9.8×1011CFU/g,含水率為0.61%,一步法真空冷凍干燥后樣品菌體濃度為5.8×1011CFU/g,含水率為1.94%,兩步法的凍干效果明顯高于一步法,具有良好的推廣應用前景。
　　 5、以植物乳桿菌NCU116菌劑作為直投式發(fā)酵劑,研究傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜與直投式發(fā)酵泡菜過程中Ph值、酸度以及腸道病原菌(大腸菌群、沙門氏菌

9、與金黃色葡萄球菌)的變化。結(jié)果表明,直投式發(fā)酵泡菜工藝可大幅度提高產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸能力,明顯加快泡菜發(fā)酵速度、縮短發(fā)酵時間;可顯著降低泡菜發(fā)酵過程中三種病原菌的數(shù)量(P＜0.05),使其數(shù)量一直處于較低水平,且在發(fā)酵的第2d消失,表明直投式發(fā)酵泡菜中植物乳桿菌NCU116對泡菜發(fā)酵過程中病原菌的生長具有顯著的抑制作用。
　　 6、模擬人體消化道環(huán)境,即在人工胃液、人工腸液、膽鹽和高鹽環(huán)境下對植物乳桿菌NCU116的耐受力進行研究。

10、結(jié)果表明,植物乳桿菌NCU116在Ph1.5和Ph2.5的人工胃液中培養(yǎng)3h,存活率分別達到了32.62%和45.76%,在Ph值3.5以上的人工胃液中能保持很高的存活率;在人工腸液中作用4h,存活率達到了49.63%;在質(zhì)量濃度0.03～1.00g/100mL的牛膽鹽中培養(yǎng)24h后,活菌數(shù)隨牛膽鹽的增加而降低,但活菌數(shù)均保持在107CFU/ML以上;在質(zhì)量濃度1～8g/100mL的NaCl高鹽環(huán)境中培養(yǎng)24h后,活菌數(shù)隨NaCl的增加

11、而稍有降低,當NaCl質(zhì)量濃度達到8g/100mL時,活菌數(shù)仍在108CFU/ML,以上。這表明植物乳桿菌NCU116對人工胃液、人工腸液、膽鹽和高鹽具有很好的耐受力,能在人體消化道中保持較好的存活率。在食品和保健品工業(yè)中具有良好的應用前景。
　　 7、在人體腸道上皮細胞和粘膜表面的黏附性能是益生菌篩選的重要標準之一。模擬人體腸道環(huán)境,采用體外細胞模型人體結(jié)腸癌細胞系HT-29考察植物乳桿菌NCU116的黏附性,并研究不同因素對

12、NCU116黏附HT-29的影響。結(jié)果顯示植物乳桿菌NCU116的黏附能力較強,達到4.784±0.21 CFU/cell。黏附菌數(shù)隨菌體濃度升高而增加,當菌體濃度達到1.0×108CFU/ML時趨于飽和。穩(wěn)定期的黏附效果較好,黏附數(shù)隨著作用時間的延長而增加,到2.0h時逐漸趨于飽和。外部環(huán)境的Ph值對黏附性質(zhì)有很大影響,偏酸性環(huán)境更有利于黏附進行。Ca2+、Mg2+對菌體與HT-29細胞的黏附作用沒有顯著影響。這表明植物乳桿菌NCU1

13、16在宿主體內(nèi)有較好的黏附性,在食品行業(yè)和保健業(yè)中具有良好的發(fā)展前景。
　　 8、以9種常見病原菌和非病原菌作為指示菌,采用牛津杯法對植物乳桿菌NCU116發(fā)酵液、菌體及代謝產(chǎn)物進行體外抑菌試驗。結(jié)果顯示NCU116對其中3株乳酸菌無抑制作用,對大腸埃希氏菌ATCC25922的抑制作用最強。進一步研究了不同濃度樣品、不同有機酸、排除有機酸及過氧化氫干擾以及經(jīng)Ph調(diào)節(jié)、熱處理、酶處理后NCU116對大腸埃希氏菌ATCC25922的