γ射線-質譜技術聯(lián)合解析YdiV二聚體及YdiV-FlhD的結構.pdf

1、蛋白質是生命功能的執(zhí)行者，生命的遺傳信息最終主要通過蛋白質的方式得到表達。而蛋白質與蛋白質相互作用形成的復合物（簡稱蛋白質復合物）是細胞內(nèi)蛋白質主要的存在形式，執(zhí)行著細胞的主要功能。蛋白質是以氨基酸為基本單位按照一定順序脫水縮合形成的聚合物，蛋白質的結構決定其功能，解析蛋白質及其復合物的結構對分子水平上闡明生命活動的基本規(guī)律具有重要的參考價值。因此，建立新型蛋白質復合物結構解析方法有助于深入了解蛋白質的作用并促進其結構和功能的研究。

2、r>　　YdiV是一個變異的EAL結構域蛋白，對細胞的移動性有負調節(jié)作用。YdiV蛋白的表達量受細菌群體感應分泌的自我誘導物分子的調控，并且能介導大腸桿菌兩套群體感應系統(tǒng)的相互作用。flhDC作為鞭毛表達的主導操縱子處于鞭毛表達整個流程最上游且最先被轉錄和翻譯，它能否順利表達也成為其他一切鞭毛蛋白表達的前提。已有研究表明，YdiV蛋白與FlhD蛋白的相互作用能影響細菌的移動性。YdiV分子通過擠入FlhD4C2內(nèi)部兩個flhD亞基形成的

3、環(huán)狀結構與FlhD4C2復合物發(fā)生結合。結合YdiV蛋白以后，flhDC的轉錄輔助因子活性喪失，下游基因轉錄受限，抑制了鞭毛蛋白的表達。
　　EAL結構域的蛋白在溶液中通常是以二聚體的形式存在，YdiV結構的一個不對稱單元中包括兩個YdiV分子(MolA和MolB)，當YdiV蛋白與FlhD4C2蛋白質復合物發(fā)生相互作用時會改變YdiV的這種二聚作用。因此，研究YdiV-YdiV同源二聚體的結構，確定二聚后的結合位點，為研究Ydi

4、V與FlhD4C2作用的結合機理奠定基礎。
　　本研究以生物化學、分子生物學、分析化學及環(huán)境毒理學為背景，結合高效液相色譜、質譜等實驗技術，提出利用γ-射線照射產(chǎn)生羥基自由基對蛋白質復合物形成前后蛋白質氨基酸側鏈進行氧化標記、聯(lián)合蛋白酶解和高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術研究解析YdiV-YdiV、YdiV-FlhD復合物結構的方法。論文主要包括以下五個部分的內(nèi)容:
　　論文第一章對蛋白質的基本資料、研究對象YdiV蛋白的基本資料

5、、YdiV蛋白結構研究現(xiàn)狀等作了簡要概述，介紹了目前蛋白質研究的技術手段進展、發(fā)展趨勢。在文獻綜述的基礎上分析了當前蛋白質研究所面臨的問題，提出了將γ-射線羥基自由基氧化標記技術、液相色譜-質譜聯(lián)用技術以及分子對接技術等聯(lián)合，用已知結構的YdiV-YdiV、YdiV-FlhD蛋白質復合物為研究對象，建立生理條件下水溶液中微量蛋白質復合物結構解析的新方法。
　　論文第二章選用與本論文研究對象分子量相當?shù)拇蟮鞍譈SA為目標蛋白，應用光

6、譜學方法對不同輻照條件下蛋白質信息變化的研究，優(yōu)化并確定照射方案和蛋白質表面氨基酸側鏈的標記技術。隨著輻照劑量的增加，自由基對蛋白質的氧化程度明顯增強，結合在蛋白質片段上的氧原子增加，引起氨基酸基團附近微環(huán)境發(fā)生明顯改變，熒光光譜實驗驗證了這一點。而吸收光譜實驗表明照射反應并未明顯改變蛋白質的結構。通過實驗我們解決了γ-射線停止照射后溶液中蛋白質繼續(xù)氧化的問題，完善了時間、劑量可控的蛋白質及其復合物γ-射線樣品照射羥基自由基氧化標記方法

7、，拓寬了γ-射線輻照技術在蛋白質復合物結構解析方面的應用范圍。
　　論文第三章解析了YdiV-YdiV二聚體的結構:對YdiV蛋白質單體及YdiV-YdiV二聚體應用上一章節(jié)中γ-射線羥基自由基氧化標記技術方法進行輻照標記，使用胰蛋白酶分別將氧化標記前后的蛋白酶解，對YdiV單體和YdiV-YdiV二聚體酶解產(chǎn)物進行液相色譜分離、質譜分析檢測確定各多肽片段的氧化標記程度，并對同一肽段照射前后的氧化標記程度進行比較，確定氧化標記程度

8、減小的(182-188)SFEPFIR多肽片段為YdiV-YdiV二聚體的結合部位。
　　論文第四章解析了YdiV-FlhD蛋白質復合物的結構，解析方法與上一章節(jié)中相似。通過胰蛋白酶特異性酶解氧化標記前后的YdiV、FlhD蛋白單體及YdiV-FlhD復合物獲得酶解產(chǎn)物，并采用液相色譜-質譜聯(lián)用技術進行定性、定量檢測，比較分析氧化標記前后同一個肽在單體和復合物中氧化標記程度的變化，最終確定YdiV-FlhD蛋白質復合物的結合部位分

9、別為:YdiV側鏈中的(153-161)AVFDGLFTR、(167-176)SFIQQQITHR、(177-183)SFEPFIR多肽片段及FlhD側鏈中的(238-245)MHTSELLK、(261-266)HIYDINLSYLLLAQR、(273-293)GINEEMATTLAALTLPQMVKI和(294-305)LAETNQLVCHFR片段。實驗結果與已有研究報道中提供的蛋白構象模型相一致，驗證了我們方法的準確性、科學性。