非病毒型載體介導(dǎo)S0D1基因體外細胞轉(zhuǎn)染及表達的實驗研究.pdf

1、第一章 SOD1真核載體的構(gòu)建及其表達
　　 目的：構(gòu)建人銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutasc，SOD1)基因真核表達載體，并在HeLa細胞中進行表達。
　　 方法：應(yīng)用RT-PCR從人外周血中擴增SOD1基因開放閱讀框(ORF)，采用TA克隆技術(shù)，將目的片段插入到pUCm-T載體中進行鑒定，重組的質(zhì)粒命名為pUCm-T-SOD1。隨后，將SOD1進一步克隆到真核表達載體pTracer

2、-CMV/Bsd中。用脂質(zhì)體將經(jīng)過測序、驗證的重組pTracer-CMV/Bsd-SOD1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，經(jīng)殺稻瘟菌素(Blasticidin)篩選4周，用Western blot檢測SODl的表達。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pTracer-CMV/Bsd-SOD1真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染成功的細胞均發(fā)綠色熒光；Western-blot檢測結(jié)果表明，所轉(zhuǎn)染

3、的SOD1在HeLa細胞中成功表達。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了能夠同時表達綠色熒光蛋白和SOD1的真核表達質(zhì)粒pTracer-CMV/Bsd-SOD1，為進一步研究SOD1在基因治療中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二章納米羥基磷灰石表面修飾及其DAN結(jié)合性能的實驗研究
　　 目的：探討納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite，nHA)的表面修飾對DNA(pTracer-CMV/Bsd-SOD1)結(jié)合能力

4、的影響。
　　 方法：采用化學共沉淀-水熱合成法制備nHA；應(yīng)用聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)對其進行表面修飾，對修飾及未修飾納米粒進行透射電鏡觀察及Zate電位檢測；凝膠電泳檢測納米粒修飾前后在不同pH值、不同濃度下與DNA結(jié)合及保護DNA抗核酸酶消化的能力。
　　 結(jié)果：經(jīng)PEI表面修飾的nHA透射電鏡下呈短棒狀，粒徑較均勻，分散程度良好，而未修飾的較易團聚及分散性差；納米粒經(jīng)表面修飾后其Ze

5、ta電位為正，其在不同pH值、不同濃度下與DNA具有較強結(jié)合及抗核酸酶消化的能力；而未修飾的nHA表面帶負電荷，與DNA結(jié)合及抗核酸酶消化的能力較差。在pH為7.0環(huán)境條件下經(jīng)表面修飾的nHA濃度為250μg/mL時能更有效結(jié)合和保護DNA，且有較好的分散性及懸浮穩(wěn)定性。
　　 結(jié)論： nHA經(jīng)PEI表面修飾后可成為一種有效的DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)運載體。
　　 第三章 PEI修飾納米羥基磷灰石載體介導(dǎo)SOD1基因體外細胞轉(zhuǎn)染的

6、實驗研究
　　 目的：探討經(jīng)聚乙烯亞胺修飾羥基磷灰石納米載體介導(dǎo)SOD1基因體外細胞轉(zhuǎn)染的效果。
　　 方法：用聚乙烯亞胺修飾納米羥基磷灰石(簡稱：nHA-PEI)；應(yīng)用集落形成實驗觀察nHA-PEI及未修飾nHA顆粒對Hela細胞的細胞毒性；用nHA-PEI、nHA及脂質(zhì)體介導(dǎo)SOD基因轉(zhuǎn)染Hela并評估其轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用RT-PCR和Western-blot進一步檢測nHA-PEI、nHA和脂質(zhì)體介導(dǎo)SOD1在基因和蛋

7、白水平的表達情況。
　　 結(jié)果：集落形成實驗觀察到nHA-PEI混懸液濃度為31.25～500μg/mL之間時對Hela細胞無明顯抑制作用，高于500μg/mL時，顯示明顯的細胞毒性，而未經(jīng)PEI修飾的nHA在整個實驗濃度范圍內(nèi)均具有良好的生物相容性和無明顯的細胞毒性；熒光顯微下觀察未經(jīng)PEI修飾的nHA轉(zhuǎn)染效率極低為5％～8％左右，經(jīng)PEI修飾的nHA，隨著PEI修飾濃度的增加，轉(zhuǎn)染效率也隨之增加，最高為30％左右，但仍低于脂