內(nèi)皮型一氧化氮合酶運輸誘導物的表達在妊娠期高血壓疾病發(fā)病機制中的作用的實驗研究.pdf

1、第一部分妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶運輸介導物表達的研究 目的:通過測定妊娠期高血壓疾病孕婦胎盤組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶運輸介導物(NOSTRIN)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達，探討NOSTRIN在妊娠期高血壓疾病發(fā)病中的作用機制。 方法:逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測23例妊娠期高血壓疾病患者(病例組)和17例正常晚孕婦女(正常組)胎盤組織中NOSTRINmRNA的表達；West

2、ernblot檢測胎盤組織中NOSTRIN和eNOS蛋白質(zhì)的表達；免疫組化染色法檢測胎盤組織中NOSTRIN的表達，通過高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)對其定量分析；HE染色觀察胎盤絨毛血管病變；分光光度法測定胎盤組織中eNOS的活性；硝酸還原酶法測定胎盤組織中和外周血中的NO代謝產(chǎn)物亞硝酸基/亞硝基(NO2-/NO3-)。 結果:病例組胎盤組織中NOSTRINmRNA呈強表達，明顯高于正常組(P＜0.01)；Westernblot

3、顯示兩組胎盤組織中均有58kDa的NOSTRIN蛋白質(zhì)表達，但病例組表達量明顯增高(P＜0.01)，同時也均有145kDa的eNOS蛋白質(zhì)表達，兩組比較表達量無差異(P＞0.05)；免疫組化染色定量分析發(fā)現(xiàn)，NOSTRIN在病例組胎盤組織中的表達明顯高于正常組(P＜0.01)；HE染色可見病例組胎盤細小血管壁增厚，管壁纖維素樣壞死發(fā)生率顯著高于正常組(P＜O.01)；病例組患者胎盤組織eNOS活性(13.727±3.58U/mg)與正常

4、組(21.69±3.84U/mg)比較降低顯著(P＜0.01)；病例組孕婦胎盤組織中的NO2-/NO3-(27.53±7.48μmol/mg)與正常組(54.27±9.53μmol/mg)比較顯著降低(P＜0.01)；病例組孕婦外周血清NO2-/NO3-(38.56±8.49μmol/l)與正常組(65.37±9.61μmol/l)比較顯著降低(P＜0.01)；病例組胎盤組織中NOSTRN表達水平與eNOS活性呈負相關(r=-0.57，

5、P＜0.01)。 結論:妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中NOSTRIN表達水平明顯升高，eNOS活性降低，這可能在妊娠期高血壓疾病的發(fā)病中起重要作用。 第二部分NOSTRIN基因克隆及其在HUVEC中的表達 目的:構建內(nèi)皮型一氧化氮合酶運輸介導物(endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer,NOSTRIN)基因的真核表達載體，通過質(zhì)粒用NOSTRIN真核表達載體轉染人

6、臍靜脈內(nèi)皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)獲得高表達NOSTRIN基因的細胞克隆。 方法:以質(zhì)粒pcDNA3.1為載體，將NOSTRINcDNA插入后得到NOSTRIN真核表達載體。采用脂質(zhì)體介導將重組質(zhì)粒導入體外培養(yǎng)的HUVEC，Westernblot檢測轉染細胞和未轉染細胞中NOSTRIN蛋白質(zhì)的表達。 結果:酶切電泳和基因測序證實，成功構建了真核表達載體pcD

7、NA3.1-NOSTRIN。并用脂質(zhì)體介導的方法獲得了高穩(wěn)定表達NOSTRIN的細胞克??；Westernblot顯示轉染前后的細胞均有58KD的蛋白質(zhì)表達，轉染后表達量明顯增高。 結論:重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NOSTRIN經(jīng)轉染能在HUVEC細胞中高效表達，為進一步研究NOSTRIN對HUVEC的生物學影響奠定了基礎。 第三部分NOSTRIN基因高表達誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞生物活性改變的研究 目的:研究人內(nèi)皮型

8、一氧化氮合酶運輸介導物(endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer,NOSTRIN)基因在體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)中的過度表達對該細胞生物學特性的影響。 方法:脂質(zhì)體法將pcDNA3.1-NOSTRIN真核表達載體及空載體分別轉染體外培養(yǎng)的HUVEC，并設未轉染細胞為對照組，G418篩選陽性克隆。免

9、疫組織化學法檢測NOSTRIN的表達部位及FⅧRAg的表達；Westernblot檢測上述處理細胞中NOSTRIN和eNOS蛋白質(zhì)的表達；分光光度法和硝酸還原酶法分別測定細胞培養(yǎng)上清中eNOS的活性和NO代謝產(chǎn)物亞硝酸基/亞硝基(NO2-/NO3-)水平；光鏡、電鏡觀察細胞的形態(tài)和超微結構。 結果:免疫組織化學證實轉染前后細胞均為血管內(nèi)皮來源細胞，三組均在細胞膜和胞漿表達NOSTRIN；Westernblot顯示細胞轉染前后均表

10、達58KD的NOSTRIN，但轉染pcDNA3.1-NOSTRIN后表達量明顯增高，同時也均有145KD的eNOS蛋白質(zhì)表達，表達量無差異(P＞0.05)；轉染pcDNA3.1-NOSTRIN細胞培養(yǎng)上清eNOS活性(11.727±3.09U/ml)與未轉染細胞(22.69±3.36U/ml)和對照組細胞(21.85±3.47U/ml)比較降低顯著(P＜0.01)，同時轉染pcDNA3.1-NOSTRIN細胞培養(yǎng)上清中NO2-/NO3-

11、為(25.56±2.49μmol/l)，與未轉染細胞(48.37±2.61μmol/l)和對照組(49.06±2.78μmol/l)比較顯著降低(P＜0.01)；光鏡和電鏡觀察看到轉染NOSTRIN后對HUVEC有損傷作用(HUVEC拉長、微絨毛變短、細胞膜損傷，胞漿內(nèi)有脂滴空泡，核膜不完整)。 結論:NOSTRIN的高表達影響了HUVEC的生物學特性，對HUVEC有明顯的損傷作用，這可能是妊娠期高血壓疾病發(fā)病重要環(huán)節(jié)之一。

12、 第四部分TNF-a上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞中NOSTRIN基因的表達 目的:探討腫瘤壞死因子-a(TNF-a)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶運輸介導物(NOSTRIN)基因表達的調(diào)控作用。 方法:將培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞分為3組：1組為用妊娠期高血壓疾病患者(HDCP)血清作用的臍靜脈內(nèi)皮細胞，2組為用正常晚孕婦女血清作用的臍靜脈內(nèi)皮細胞，3組為無任何處理的HUVEC。用逆轉錄－聚合酶鏈反應檢測兩組細胞中NOSTRI

13、NmRNA的表達。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測HDCP患者和正常孕婦血清中TNF-a含量。用1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml3種濃度的TNF-a分別作用HUVEC細胞株6h，以及用濃度為3ng/ml的TNF-a作用HUVEC細胞分別長達6h、12h、24h，逆轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測NOSTRINmRNA的表達；將二硫代氨基甲酸吡硌烷(PDTC，5mmol/ml)與TNF-a(3ng/ml)同時作用以及TNF

14、-a(3ng/ml)單獨作用HUVEC細胞6h，RT-PCR檢測NOSTRIN基因mRNA的表達。 結果:三組細胞中都有NOSTRIN表達，1組表達量顯著高于2組和3組(P＜0.01)。ELISA結果顯示，HDCP患者血清中TNF-a含量顯著高于正常晚孕婦女(P＜0.01)。TNF-a作用HUVEC細胞后NOSTRIN表達顯著高表達，并成時間和劑量依賴關系(P＜0.01)。PDTC和TNF-a同時作用的HUVEC和TNF-a單獨