同時(shí)抑制NF-κB和XIAP以胰腺癌細(xì)胞吉西化濱敏感性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：胰腺癌是一種高度惡性、致死的腫瘤，起病隱匿，早期無癥狀，就診時(shí)多為晚期(80-85％)。目前，化療是晚期胰腺癌患者主要治療方案，吉西他濱單藥化療是其一線治療方法。然而，大多數(shù)患者對(duì)吉西他濱耐藥。對(duì)吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抵抗是胰腺癌化療耐藥的機(jī)制之一。因而迫切需要找到新的分子治療靶點(diǎn)，逆轉(zhuǎn)胰腺癌化療耐藥，改善預(yù)后。NF-κB和XIAP能抑制各種應(yīng)激誘發(fā)的凋亡，是癌癥治療中潛在的靶點(diǎn)。在胰腺癌細(xì)胞中NF-κB或XIAP異常增高，與其化

2、療抵抗密切相關(guān)，但是僅僅抑制NF-κB或XIAP表達(dá)不能理想地改善胰腺癌的化療抵抗。NF-κB是一種遍在轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)XIAP的轉(zhuǎn)錄;在內(nèi)皮細(xì)胞中，XIAP也可以調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)，從而逃避細(xì)胞凋亡。我們推測在胰腺癌細(xì)胞中NF-κB與XIAP也能相互正向調(diào)節(jié)，形成正反饋循環(huán)，同時(shí)表達(dá)升高，導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療不敏感。本課題主要研究同時(shí)靶向抑制NF-κB以及XIAP的表達(dá)對(duì)腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響及其機(jī)制;尋找逆轉(zhuǎn)胰腺癌化療抵抗的有

3、效分子靶點(diǎn)，改善胰腺癌患者預(yù)后。
　　方法：①體外培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株Mia PaCa-2及Panc-1，用不同濃度的吉西他濱(0.01-100μM)處理，CCK法檢測細(xì)胞生存，繪制生存曲線，檢測吉西他濱的LD50，確定吉西他濱耐藥株及敏感株。分兩組培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞，對(duì)照組及吉西他濱處理組，EMSA法檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性，western blot法檢測XIAP蛋白表達(dá)。②構(gòu)建靶向作用于NF-κB亞基p65及XIAP的質(zhì)粒載體(

4、p65-shRNA、XIAP-shRNA)，轉(zhuǎn)染Mia PaCa-2及Panc-1，檢測轉(zhuǎn)染率。Real timeRT-PCR法檢測p65 mRNA和XIAP mRNA，Western blot檢測p65蛋白和XIAP蛋白，檢測RNAi對(duì)靶基因的抑制情況。③分四組培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞Mia PaCa-2及Panc-1，正常培養(yǎng)組、吉西他濱處理組、p65-shRNA載體轉(zhuǎn)染組、p65-shRNA載體轉(zhuǎn)染組聯(lián)合吉西他濱組，Annexin V法檢測

5、各組細(xì)胞凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理同前，EMSA法檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性，Western blot法檢測XIAP蛋白。④分組培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞Mia PaCa-2及Pane-1，正常培養(yǎng)組、吉西他濱處理組、XIAP-shRNA載體轉(zhuǎn)染組、XIAP-shRNA載體轉(zhuǎn)染聯(lián)合吉西他濱組，Annexin V法檢測各組細(xì)胞凋亡。Western blot法檢測XIAP蛋白，EMSA法檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性。細(xì)胞培養(yǎng)及分組同前，搜集細(xì)胞，行

6、Western blot檢測IKKβ、IκBα蛋白。⑤分組培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞Mia PaCa-2及Panc-1，分四組處理:吉西他濱組、XIAP-shRNA載體轉(zhuǎn)染聯(lián)合吉西他濱組、p65-shRNA載體轉(zhuǎn)染聯(lián)合吉西他濱組、XIAP-shRNA載體、p65-shRNA載體共轉(zhuǎn)染聯(lián)合吉西他濱組，AnnexinV法檢測各組細(xì)胞凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)同前，EMSA法檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性，Western blot法檢測XIAP蛋白。
　　結(jié)果

7、：①M(fèi)ia PaCa-2吉西他濱LD50約1μM，相應(yīng)的，吉西他濱對(duì)Panc-1的LD50大于50μM，確定Mia PaCa-2為吉西他濱敏感株，Panc-1為吉西他濱耐藥株。在Mia PaCa-2和Panc-1中，NF-κB的DNA結(jié)合活性及XIAP蛋白表達(dá)均增高，且敏感株Mia PaCa-2中的NF-κB活性和XIAP蛋白均比耐藥株P(guān)anc-1低(P＜0.05)。吉西他濱可以誘導(dǎo)兩種細(xì)胞中的NF-κB活性增強(qiáng)，XIAP表達(dá)增加(P＜

8、0.05)。②p65-shRNA載體、XIAP-shRNA載體、陰性載體可以高效地轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2和Panc-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率均在80％以上。p65-shRNA載體、XIAP-shRNA載體對(duì)MiaPaCa-2及Panc-1細(xì)胞的p65 mRNA抑制率約80％以上(P＜0.05)，對(duì)相應(yīng)蛋白的抑制率均達(dá)到80％以上(P＜0.05)，陰性載體對(duì)p65、XIAP mRNA及蛋白表達(dá)無影響(P＜0.05)。③在敏感細(xì)胞Mia PaCa-2

9、和耐藥細(xì)胞Panc-1中，p65-shRNA載體轉(zhuǎn)染結(jié)合吉西他濱較吉西他濱單用，可以增加細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)，但效果不理想，凋亡率僅達(dá)到(19.7±1.9)％、(14.9±1.6)％。P65-shRNA載體介導(dǎo)的RNAi可以有效地抑制吉西他濱誘導(dǎo)的p65蛋白的表達(dá)，同時(shí)伴隨有XIAP蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)。④XIAP-shRNA載體轉(zhuǎn)染結(jié)合吉西他濱處理組，在兩種胰腺癌細(xì)胞中，均可以增加細(xì)胞凋亡率，但凋亡率偏低，分別僅為:(1

10、8.6±2.0)％、(11.6±1.3)％。XIAP-shRNA載體介導(dǎo)的RNAi能有效地抑制XIAP蛋白的表達(dá)，同時(shí)伴有NF-κB DNA結(jié)合活性下降、IKKβ蛋白下降、IκBα蛋白增加(P＜0.05)。⑤在敏感細(xì)胞Mia PaCa-2和耐藥細(xì)胞Panc-1中，XIAP-shRNA、p65-shRNA載體共轉(zhuǎn)染結(jié)合吉西他濱較XIAP-shRNA載體轉(zhuǎn)染結(jié)合吉西他濱或p65-shRNA載體結(jié)合吉西他濱處理組，細(xì)胞凋亡率顯著增加(p＜0.